Péptidos inmunógenos antitumorales y vacuna que los contiene.

Péptidos inmunógenos que comprenden la secuencia QKEASI (SEQ ID NO:

1) perteneciente a la región decisteína 2 a cisteína 3 del dominio Frizzled2 de la proteína Corina de mamífero, teniendo dichos péptidos unalongitud de 8 a 12 aminoácidos.

Péptidos inmunógenos antitumorales y vacuna que los contiene La presente invención se refiere a nuevas secuencias de péptidos inmunógenos en conexión con tumores, particularmente el carcinoma de colon rectal y usos de los mismos para la preparación de vacunas.

Es sabido que la proteína Corina es una serina-proteasa transmembranal tipo II que actúa como convertasa del factor natriurético proatrial (proANP) en el corazón (Yan et al. 1999) . Por consiguiente, el patrón de expresión de Corina se considera muy similar al de los péptidos natriuréticos.

Además del corazón, se ha detectado la expresión de Corina (AF133845) en otros tejidos, como el riñón durante el desarrollo, los huesos y el útero. Aún más sorprendentemente, se ha detectado también la expresión de Corina en diversos sarcomas y carcinomas, como el carcinoma de pulmón, el cáncer de pulmón microcítico (SCLC) (Wu et al. 2003) , osteosarcomas, leiomiosarcomas, carcinomas endometriales, pero no se han descrito todavía resultados del análisis de la expresión en colon o carcinoma de colon (como resulta de la investigación de referencia en PubMed

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/quer y .fcgi) .

La proteína Corina es una proteasa que, además del dominio de serina-proteasa, presenta en la región extracelular dos dominios ricos en cisteína (semejantes a Frizzled) que son comunes al factor interactivo Wnt pero no proteínas proteasa semejantes a tripsina (serina-proteasa) . Las secuencias de aminoácidos de Corina de rata, ratón y humana junto con otras proteínas "Frizzled" (Fz, receptor soluble o transmembranal) están representadas también alineadas en la Figura 1 para mostrar el alto grado de conservación de dominios ricos en cisteína (CRD) . Estos dominios incluyen aproximadamente 120 aminoácidos con patrón inalterado de 10 residuos cisteína (numerados en la parte inferior de la figura) que forman 5 puentes bisulfuro que dan como resultado estructuras de hélice alfa. La región entre los residuos cisteína segundo y tercero se representa con mayor detalle en la Figura 2. Si bien la correlación de la activación inadecuada del sistema de transducción de factores Wnt/Fz con la carcinogénesis es conocida (Holcombe et al., 2002; Vincan et al. 2003) , no ocurre lo mismo para la relación del último y serina-proteasa con dominios semejantes a Frizzled, por ejemplo Corina.

Hasta ahora, persiste la necesidad de proporcionar nuevas vacunas contra tumores adecuadas para generar una respuesta inmune apropiada para refrenar el crecimiento de los tumores, para utilización en combinación con quimioterapia o radioterapia.

En este contexto, WO 01/62786 describe un péptido de sistema proteínico TLP (SEQ ID NO: 2) o fragmentos del mismo para ser utilizados como antígenos en una vacuna anti-tumoral, particularmente tumor de pulmón. Específicamente, WO 98/15282 describe varios péptidos TLP con secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 descritas ya en WO-A-9401458, para ser utilizadas como inmunógenos para la preparación de vacunas anti-tumor, particularmente para tumores de pulmón y urogenitales y para el carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC) .

Sin embargo, los péptidos indicados anteriormente adolecen de la desventaja de ser escasamente inmunógenos como se consigna en WO 03/045997, en donde se describen proteínas de fusión de estos péptidos e IL-2 y el uso de las mismas como antígenos anti-tumorales para la prevención y el tratamiento de diversos tumores.

WO9964608 describe una proteína de fusión obtenida a partir de una combinación de péptidos TLP e interleuquina-2 y su uso en la inmunoterapia del cáncer.

El carcinoma de colon es una de las patologías más frecuentes en los países desarrollados. En Europa, tanto en varones como en mujeres, el tumor de colon rectal es la segunda neoplasia más difundida (Ferlay et al., 1999) . La incidencia del mismo es mayor en las poblaciones caucasianas europeas que en las asiáticas y africanas (Parkin et al., 2002) .

Los autores de la presente invención han descubierto ahora varias secuencias peptídicas con una de dominios de Corina ricos en cisteína (NCBI NC_00004; gi: 37625049) , capaces de actuar como inmunógenos para proporcionar una vacuna anti-tumoral diseñada específicamente para la población caucasiana (alelos HLA A0210, HLA A03, HLA B0702, HLA B2705, HLA B5101) .

Las células T y B reconocen antígenos proteínicos de acuerdo con patrones sustancialmente diferentes. Si bien los receptores y anticuerpos de las células B reconocen el antígeno en solución y fijan epítopes lineales o ensamblados de 15-22 aminoácidos, los receptores de las células T reconocen el antígeno después de la degradación proteolítica dando como resultado epítopes segmentales de 8-11 y 12-25 aminoácidos unidos respectivamente a moléculas de clase I y II codificadas por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) . La diferente longitud de los péptidos presentados por el MHC es función de la especie y el alelo MHC I-II particular del individuo. En los humanos, particularmente, la longitud media de los epítopes proteínicos de HLA tipo I es 9-10 aminoácidos. Por consiguiente, con objeto de poder ser utilizados como antígeno presentado efectivamente por diferentes HLA de la población caucasiana, los péptidos de acuerdo con la invención tienen que ser como mínimo nonámeros, dado que, como es sabido, la bolsa del MHC humano prefiere péptidos de 9-10 aminoácidos, mientras que con péptidos de 8 ó 12 aminoácidos la presentación de antígeno es menos efectiva.

Los autores, por medio de ensayos ELISPOT (véase Ejemplo 1, Figura 3) han demostrado que estos péptidos son más inmunógenos debido a que generan mayor respuesta específica de antígeno en linfocitos de ratas inoculadas con tumor de colon DHD-K12 que el péptido descrito en WO 98/15282 y WO-A-9401458 que tiene SEQ ID NO: 1 RTNKEASI, cuya escasa inmunogenicidad ha sido ya consignada en WO 03/045997. Adicionalmente, el epítope RTNKEASI no existe naturalmente, ni se detecta en la secuencia de Corina de mamífero. El efecto de la respuesta inmune es principalmente purificar las células epítope-positivas o suprimir la expresión del epítope y generar una diferenciación de las células implicadas. Dado que el epítope RTNKEASI no es la secuencia existente naturalmente, era imposible detectar epítopes inmunógenos que no den resultados autoinmunes o positivos falsos en la respuesta inmune por la vía de reconocimiento de epítopes no existentes naturalmente.

Por consiguiente, péptidos inmunógenos que comprenden la secuencia QKEASI (SEQ ID NO: 1) perteneciente a la región de cisteína 2 a cisteína 3 del dominio Frizzled2 de la proteína Corina de mamífero, teniendo dichos péptidos una longitud de 8 a 12 aminoácidos, representan un objeto de la presente invención.

De acuerdo con una realización preferida, los péptidos de acuerdo con la invención comprenden el epítope RTQKEASI (SEQ ID NO: 2) , localizado entre los residuos cisteína 2 y 3 del dominio Frizzled2 de Corina (dominio Frizzled 2, posiciones de Corina 531-570) .

De acuerdo con un aspecto particularmente preferido de la presente invención (adaptabilidad a la bolsa del MHC humano que da como resultado una presentación de antígeno efectiva) los péptidos pueden ser nonámeros o decámeros. Preferiblemente, los péptidos de acuerdo con la invención comprenden la secuencia HRTQKEASI (SEQ ID NO: 3) (posiciones de Corina 548-555) o RTQKEASIC (SEQ ID NO: 4) .

De acuerdo con una realización adicional, los péptidos de la invención como se han definido arriba pueden ser tales que el residuo de aminoácido R esté reemplazado con M o P y/o el residuo de aminoácido T esté reemplazado con E, para optimizar adicionalmente la interacción del péptido con diversos haplotipos HLA-1.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, los péptidos pueden caracterizarse porque tienen un residuo cisteína en el extremo del término C.

Más particularmente, los péptidos de acuerdo con la invención pueden seleccionarse del grupo constituido por: HRTQKEASI (SEQ ID No:3) , HMTQKEASI (SEQ ID No:5) , HREQKEASI (SEQ ID No:6) , REQKEASI (SEQ ID No:7) , MTQKEASI (SEQ ID No:8) , RTQKEASI (SEQ ID No:2) , HRTQKEASIC (SEQ ID No:9) , RTQKEASIC (SEQ ID No:4) , MTQKEASIC (SEQ ID No:10) , REQKEASIC (SEQ ID No:11) , HMTQKEASIC (SEQ ID No:12) , y HREQKEASIC (SEQ ID No:13) .

Alternativamente, péptidos como los anteriores pueden estar protegidos en el término N o el término C para evitar la digestión antes que ocurra la estimulación inmune. O bien, los aminoácidos de la secuencia pueden reemplazarse con residuos menos susceptibles a la hidrólisis.

Las secuencias... [Seguir leyendo]

1. Péptidos inmunógenos que comprenden la secuencia QKEASI (SEQ ID NO: 1) perteneciente a la región de cisteína 2 a cisteína 3 del dominio Frizzled2 de la proteína Corina de mamífero, teniendo dichos péptidos una longitud de 8 a 12 aminoácidos.

2. Péptidos de acuerdo con la reivindicación 1, que comprenden el epítope RTQKEASI (SEQ ID NO: 2) .

3. Péptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que son nonámeros o decámeros.

4. Péptidos de acuerdo con la reivindicación 3, que comprenden la secuencia HRTQKEASI (SEQ ID NO: 3) o RTQKEASIC (SEQ ID NO: 4) .

5. Péptidos de acuerdo con la reivindicación 2 ó 4 en los cuales el residuo de aminoácido R está reemplazado con M o P y/o el residuo de aminoácido T está reemplazado con E.

6. Péptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizados porque tienen un residuo cisteína en el extremo del término C.

7. Péptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, que tienen una secuencia seleccionada del grupo constituido por HRTQKEASI (SEQ ID No:3) , HMTQKEASI (SEQ ID No:5) , HREQKEASI (SEQ ID No:6) , REQKEASI (SEQ ID No:7) , MTQKEASI (SEQ ID No:8) , RTQKEASI (SEQ ID No:2) .

8. Péptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6 que tienen una secuencia seleccionada del grupo constituido por HRTQKEASIC (SEQ ID No:9) , RTQKEASIC (SEQ ID No:4) , MTQKEASIC (SEQ ID No:10) , REQKEASIC (SEQ ID No:11) , HMTQKEASIC (SEQ ID No:12) , HREQKEASIC (SEQ ID No:13) .

9. Péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, protegidos en el término N o en el término C. 10. Secuencia de DNA que codifica al menos uno de los péptidos definidos en las reivindicaciones de 1 a 8. 11. Vector de expresión que comprende al menos una secuencia de DNA como se define en la reivindicación 10. 12. Vector de acuerdo con la reivindicación 11 que comprende adicionalmente la secuencia que codifica un

compuesto inmunomodulador seleccionado del grupo constituido por quimioquinas y citoquinas inmunomoduladoras.

13. Vector de acuerdo con la reivindicación 12 en el cual dichas quimioquinas y citoquinas se seleccionan del grupo constituido por IL-12, IL-2, INF-gamma y GM-CSF. 14. Uso de péptidos como se definen en las reivindicaciones 1 a 9 o vector de expresión como se define en las

reivindicaciones 11-13 para la preparación de una vacuna para el tratamiento preventivo de tumores en individuos pertenecientes a población caucasiana. 15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14 en el cual el tumor es carcinoma de colon rectal.

16. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 15 en asociación con al menos un agente quimioterapéutico.

17. Vacuna antitumoral que comprende al menos uno de los péptidos que se definen en las reivindicaciones 1 a 9 o el vector de expresión como se define en las reivindicaciones 11-13, junto con adyuvantes y excipientes farmacológicamente aceptables.

18. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 17, estando dirigida dicha vacuna contra el carcinoma de colon rectal.

19. Anticuerpos monoclonales u oligoclonales específicos para uno de los péptidos que se definen en las reivindicaciones de 1 a 8.

20. Uso de los anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 19 para la preparación de un medicamento para el

tratamiento de tumores. 21. Uso de acuerdo con la reivindicación 20 en el cual el tumor es carcinoma de colon rectal. 22. Método para la determinación in vitro de la existencia de un tumor o seguimiento del paciente que padece el

tumor en una muestra biológica, que comprende el uso de los anticuerpos monoclonales o policlonales que se

definen en la reivindicación 19. 23. Kit de diagnóstico que comprende los anticuerpos monoclonales u oligoclonales que se definen en la reivindicación 19 para determinación de la presencia de un tumor en una muestra biológica.

24. Kit de acuerdo con la reivindicación 23 en el cual el tumor es carcinoma de colon rectal.

Humana

Ratón

Rata

Consenso Volumen de tumor (ml)