PARTICULAS MAGNÉTICO-LUMINISCENTES PARA APLICACIONES BIOMÉDICAS.

La presente invención se refiere a un sistema de partículas magnético luminiscentes de tamaño inferior a 3 micras,

de forma particular igual o inferior a 500 nm, que comprende una matriz de silicio poroso nanoestructurado, donde dicha matriz comprende en sus poros nanopartículas de material magnético y nanocristales de silicio, así como a un procedimiento para su preparación. Dichas partículas pueden ser funcionalizadas con grupos o moléculas que permiten la unión de bio-moléculas en su superficie, lo que les hace ser especialmente útiles en aplicaciones biomédicas.

Partículas magnético-luminiscentes para aplicaciones biomédicas. Campo de la invención

La presente invención se encuadra dentro del campo de los biosensores, más concretamente se refiere a sistemas híbridos nanoparticulados con propiedades magnéticas y luminiscentes para su aplicación en imagen, monitorización, liberación de fármacos y biodetección, así como a procedimientos para su obtención. Antecedentes La aplicación de nanoestructuras basadas en semiconductores de tamaño y composición controlada está siendo progresivamente implementada en multitud de campos pertenecientes a la biotecnología [Wang, Y. et al., Bioapplication of nanosemiconductors. Mat. Today, 2005, 8 (Suppl. 1) , 20-31; Jianrong, C. et al., Nanotechnology and biosensors, Biotechnol. Adv., 2004, 22, 505-518], El control sistemático de dicha propiedades de las nanoestructuras contrasta con la naturaleza de las especies moleculares cuyas propiedades no varían sistemáticamente. Este control de las variaciones de las propiedades no sólo mejora las aplicaciones tradicionales, sino que abre las puertas a las nuevas aplicaciones más allá de los bioconjugados moleculares convencionales.

La disponibilidad de estas nuevas nanoestructuras facilita la creación de nuevos métodos de monitorización in situ y de diseño de sensores. Así, se han venido desarrollando partículas bio-magnéticas modificadas en su superficie para su aplicación en inmunoensayos, ingeniería genética, separación celular, purificación de complejos, localización intracelular, destinos específicos de células etc... Estas partículas comprenden óxidos ferromagnéticos, superparamagnéticos o paramagnéticos de hierro, cobalto o níquel como núcleo metálico, recubiertas por un material que presenta grupos funcionales orgánicos a los cuales se unen de forma covalente moléculas con compatibilidad biológica contrastada.

Por otra parte, es también de sobra conocido en biotecnología y biología molecular las aplicaciones técnicas usando moléculas con fluorescencia. Existen numerosos materiales fluorescentes que son empleados para etiquetar células o moléculas, tales como sondas fluorescentes orgánicas, puntos cuánticos, etc. La incorporación de estos cromóforos en las partículas bio-magnéticas permite la creación de sistemas híbridos que presentan tanto propiedades magnéticas como fluorescentes, haciendo posible el desarrollo de nuevos sistemas híbridos para imagen, monitorización, liberación de fármacos y biodetección.

Así, en los últimos años se han desarrollado sistemas híbridos nanoparticulados magnético-luminiscentes en donde el material o matriz constitutiva de los mismos es óxido de silicio. Insin, N. et al [ACS Nano, 2008, 2 (2) , 197-202] describen la elaboración de microesferas de sílice con propiedades magnéticas y luminiscentes mediante la incorporación de nanopartículas magnéticas de γ-Fe2O3 y puntos cuánticos de CdSe/CdZnS en una capa de sílice que se ubica como recubrimiento sobre microesferas de sílice preformadas. Existen otros documentos que describen la preparación de partículas cuyo núcleo está constituido por material magnético recubierto por una capa de sílice, que incorporan el elemento fluorescente bien en la capa de sílice o dopando el núcleo magnético [WO2007/029980, WO2005/015213, WO2008/115854, WO03/089906],

Las nanoestructuras porosas ofrecen la ventaja adicional de poseer una muy alta superficie específica que revierte en una alta reactividad química, lo que facilita enormemente la conjugación con moléculas y biomoléculas. Así, se han diseñado nanopartículas a partir de una estructura de sílice mesoporosa en cuyos poros se insertan nanopartículas magnéticas de Fe3O4 y puntos cuánticos semiconductores (QDs) , recubiertas con un polímero anfifílico capaz de mejorar su biocompatibilidad [Sathe, T.R. et al., Anal. Chem., 2006, 78, 5627-32], WO2009/078924 describe una estructura de dimensión menor a una micra, formada por un cuerpo de sílice poroso que incorpora nanopartículas de óxido de hierro y moléculas fluorescentes en el interior de los poros de la mencionada estructura. Sobre el cuerpo de sílice se encuentran unidas moléculas aniónicas que permiten la unión con bio-moléculas.

No obstante, uno de los principales inconvenientes que presentan estas estructuras se deriva de la presencia del elemento fluorescente. Aunque los puntos cuánticos presentan multitud de ventajas sobre los fluoróforos orgánicos, como pueden ser la selección de la longitud de onda de emisión, una amplia banda de absorción en el espectro, un espectro de emisión muy estrecho, así como altos niveles de intensidad luminiscente y fotoestabilidad, éstos suelen resultar en la mayoría de los casos tóxicos debido a que incluyen metales pesados tales como cadmio, zinc, cobalto y similares.

Por otra parte, debido al procedimiento de obtención basado en la mezcla física de soluciones que contiene los distintos componentes y posterior precipitación, no es fácil controlar la concentración final de metal ferromagnético infiltrado en la matriz, lo que limita en gran medida su aplicación posterior.

A la vista de los inconvenientes señalados, se hace necesario el desarrollo de sistemas híbridos nanoparticulados con propiedades magnéticas y luminiscentes que presenten una mayor biocompatibilidad y biodegradabilidad, y que permitan un control de la concentración de material magnético con el fin de poder variar las propiedades magnéticas en función de la aplicación particular que quiera dárseles. Breve descripción de la invención

Los autores de la presente invención han observado que partículas biofuncionales que comprenden una matriz de silicio poroso nanoestructurado como material soporte, permiten mejorar considerablemente la biocompatibilidad y biodegradabilidad de las mismas, dado que no necesitan incorporar trazadores luminiscentes adicionales, debido a que la propia matriz presenta luminiscencia intrínseca como consecuencia de la presencia de monocristales nanométricos de silicio dentro de la estructura del silicio amorfo que actúan como puntos cuánticos.

Además, la matriz de silicio poroso presenta una mayor afinidad química y una mayor superficie biocatalítica que la matriz de sílice, lo que facilita el recubrimiento con moléculas funcionales capaces de conjugarse con moléculas y biomoléculas. De hecho, las partículas funcionalizadas han sido cultivadas en presencia de células mesenquimáticas humanas hMSC, las cuales han internalizado dichas partículas y han demostrado su no toxicidad. Las células hMSC son productoras de factores inmunosupresores, facilitan factores que estimulan la reparación endógena de los tejidos y la angiogénesis, por lo que son idóneas para la terapia celular y demás aplicaciones biomédicas. Los ensayos experimentales llevados a cabo han mostrado que la máxima luminiscencia en el rango óptico se mantiene durante varios días gracias a su capa funcionalizada y, lo que es más importante, que una vez esta luminiscencia inicial desaparece, las partículas siguen siendo luminiscentes debido a la formación de nuevos centros emisores, lo que las convierte en marcadores celulares muy útiles.

Por otra parte, el procedimiento utilizado para su obtención, basado en un proceso de galvanización y posterior electro infiltración, ha permitido la incorporación de forma controlada de nanopartículas magnéticas dentro de los poros de la matriz. Hasta el momento, sólo se habían podido obtener estructuras de silicio con canales o depósitos metálicos con tamaños del orden de 10 a 20 veces superior el de los poros de la matriz nanoestructurada, para su posterior aplicación en la fabricación de dispositivos de almacenamiento de memoria y sensores magnéticos.

El mencionado procedimiento permite además controlar el tamaño de los poros así como el de los monocristales de silicio (considerados también como puntos cuánticos cuando su tamaño es nanométrico) , lo que se traduce en la posibilidad de seleccionar previamente la longitud de onda de las partículas luminiscentes, además de controlar la actividad química superficial. Se ha observado además, que la luminiscencia se mantiene incluso después de haber insertado en la estructura porosa las nanopartículas magnéticas auto-nucleadas. Adicionalmente, para aplicaciones biomédicas, las condiciones experimentales de fabricación pueden ser ajustadas de forma que el máximo de luminiscencia ocurra en el intervalo infrarrojo cercano de longitudes de onda donde los tejidos presentan una alta transparencia.

Así, en un primer aspecto la invención se dirige a un sistema de partículas magnético luminiscentes de tamaño inferior a 3 micras, que comprenden una matriz... [Seguir leyendo]

1. Un sistema de partículas magnético luminiscentes de tamaño inferior a 3 micras, que comprende una matriz de silicio poroso nanoestructurado, donde dicha matriz comprende en sus poros nanopartículas de material magnético y monocristales nanométricos de silicio.

2. Sistema según reivindicación 1, donde el tamaño de los poros de la matriz de silicio se encuentra comprendido entre 5 nm y 60 nm.

3. Sistema según reivindicaciones 1 ó 2, donde las nanopartículas de material magnético presentan un tamaño comprendido entre 5 nm y 30 nm.

4. Sistema según reivindicación 1, donde el tamaño de los nanocristales de silicio se encuentra comprendido entre 1 nm y 200 nm.

5. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el material magnético es un metal ferromagnético.

6. Sistema según reivindicación 5, donde el metal ferromagnético es hierro y/o cobalto.

7. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones1a6, donde la superficie de las partículas comprende además moléculas o grupos funcionales capaces de unirse de forma covalente a una bio-molécula

o de conjugarse con ella.

8. Sistema según reivindicación 7, donde la molécula funcional es polietilenglicol o un polímero de tipo polisacárido.

9. Sistema según reivindicación 7, donde los grupos funcionales se seleccionan entre -COOH, -CHO, NH2 y todos aquellos que proporcionen grupos silano a la superficie de la partícula.

10. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones7a9que comprende además una bio-molécula.

11. Sistema según reivindicación 10, donde la biomolécula se encuentra unida a las partículas de forma covalente.

12. Sistema según reivindicaciones 10 ú 11, donde la bio-molécula se selecciona entre el grupo consistente en un aminoácido, un péptido, una proteína, un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleótido, un ácido nucleico, una vitamina, un monosacárido, un oligosacárido, un carbohidrato y un lípido.

13. Procedimiento para la preparación de un sistema de partículas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende:

a) someter obleas de silicio a un proceso de galvanización en una disolución que comprende una mezcla de un ácido fuerte inorgánico y un alcohol, aplicando una densidad de corriente comprendida entre 10 mA/cm2 y 150 mA/cm2 para obtener obleas de silicio poroso;

b) someter las obleas de silicio poroso a un proceso de electro infiltración del material magnético mediante un modo pulsado de corrienteequilibrio por inmersión de las obleas de silicio poroso en una disolución que comprende sales de metales que constituyen el material magnético y catalitos.

c) convertir las obleas de silicio poroso infiltradas con material magnético en partículas de silicio poroso.

14. Procedimiento según reivindicación 13, donde las obleas de silicio son obleas de silicio monocristalino tipo p.

15. Procedimiento según reivindicación 14, donde las obleas de silicio monocristalino tipo p se encuentran dopadas con boro, presentan una orientación

<100> y una resistividad comprendida entre 0.1 y

0.05 Ω·cm.

16. Procedimiento según reivindicaciones 13 a 15, donde el ácido fuerte inorgánico es HF y el alcohol es etanol.

17. Procedimiento según reivindicación 16, donde el HF y el etanol se encuentran en una proporción en volumen de aproximadamente 1:1.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, donde la densidad de corriente en la etapa a) se lleva a cabo bajo condiciones de iluminación con lámpara halógena.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, donde la disolución que comprende las sales de metales que constituyen el material magnético es una disolución de Watts de cobalto/hierro.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, que además comprende una etapa de funcionalización de la superficie de las partículas.

21. Procedimiento según reivindicación 20, donde las partículas se funcionalizan con polietilenglicol.

22. Composición farmacéutica que comprende partículas magnético luminiscentes como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y una molécula biológicamente activa.

23. Composición según reivindicación 22, donde la molécula biológicamente activa se selecciona entre proteínas, péptidos, lípidos, oligonucleótidos, corticosteroides, vitaminas, agentes antifúngicos, agentes bacteriostáticos, agentes cicatrizantes, agentes antihistamínicos, agentes anestésicos, agentes antibióticos, agentes antivirales, agentes antisépticos, agentes inmunosupresores y agentes antiinflamatorios.

24. Uso de un sistema de partículas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de un medicamento.

25. Uso de un sistema de partículas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de un medicamento para terapia génica.

26. Uso de un sistema de partículas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como marcadores celulares.

27. Uso de un sistema de partículas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como agentes de contraste en resonancia magnética nuclear.

28. Uso de un sistema de partículas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para separación magnética asistida de productos químicos

o bio-químicos.