Oligonucleótidos y usos de los mismos.

Un metodo para determinar simultaneamente el niimero de repeticiones en tandem enpolinucleOtidos diana en un locus polimOrfico dado del que se sabe que tiene multiples alelos quevarian en el ntImero de repeticiones en tandem,

el metodo comprendiendo:

(a) proporcionar una muestra que contiene los polinucleotidos diana, donde dos o mas de lasrepeticiones en tandem en los polinucleOtidos diana se encuentran en forma de cadena simple,(al) hibridar un oligonucleOtido de bloqueo a por lo menos una pero no todas las repeticiones entandem en los polinucleOtidos diana proporcionados en el paso (a) para que una o mas de lasrepeticiones en tandem en los polinucleOtidos diana permanezca en forma de cadena simpledespues de la hibridaciOn de los oligonucleotidos de bloqueo,

(b) la hibridar un oligonucleotido sonda etiquetado con la parte de cadena simple de lospolinucleotidos diana, donde el oligonucleotido sonda es complementario de al menos una de lasrepeticiones en tandem, y al menos 5 nucleOtidos del oligonucleotido sonda son complementariosde las repeticiones en tandem, en la parte de cadena simple de los polinucleotidos diana, endonde el oligonucleotido sonda es uno que permite la discriminacion entre diferentes nOmeros derepeticiones en tandem en la parte de cadena simple de los polinucleOtidos diana de acuerdo asu temperatura de fusion (Tm), y donde el oligonucleotido sonda es total o parcialmentecomplementario de al menos una repetici6n en tandem en la parte de cadena simple de lospolinucleotidos diana.

(c) determinar simultaneamente el nOrnero de repeticiones en tandem en los polinucleOtidosdiana en base a la hibridaci6n del oligonucleotido sonda a la porci6n de cadena simple de lospolinucleotidos diana y su temperatura de fusion.

La presente invención se refiere a oligonucleótidos, yen particular a su uso en la detección de repeticiones en tándem en ADN. [0002] Se conocen multitud de técnicas y sistemas de sonda para la detección de secuencias específicas de ADN y anotación de polimorfismo de nucleótido simple (SNP) , incluyendo la reacción homogénea en cadena de la polimerasa (PCR) , sondas TaqMan TM, sondas Eclipse, balizas moleculares, iniciadores Scorpion, sondas de hibridación simples, sondas ResonSense, Sondas Gene-Pin y Balizas de Hibridación (HyBeacons ®) . Estas se discuten, por ejemplo, en nuestras solicitudes de patente anteriores WO 01/73118 y WO 2007/010268. [0003] Aunque muchos polimorfismos y mutaciones de ADN son SNP, muchos se deben a repeticiones en tándem de secuencias de ADN. Por lo general, en la actualidad, tales repeticiones en el ADN genómico son analizadas por un análisis del tamaño o por secuenciación del ADN, por ejemplo después de la amplificación por PCR de la secuencia de ADN diana. Aunque se han hecho intentos de usar sistemas de sondas de oligonucleótidos para identificar repeticiones en tándem en el ADN (por ejemplo, ver Radtkey et al (2000) Nucl. Acids Res. 28, E17 (i-vi», hasta ahora no ha habido una forma práctica de analizar estas secuencias repetidas utilizando sondas de hibridación. [0004] las huellas o el perfil del ADN fueron descubiertos por Alec Jeffreys después del descubrimiento de secuencias repetidas de ADN en el genoma humano (Jeffreys, 1985a, 1985b) . Las secuencias repetidas denominadas STRs (repeticiones cortas en tandem) o VNTR (número variable de repeticiones en tándem) resultaron ser de longitudes diferentes en diferentes individuos. En la primera descripción del perfil de ADN, un número de estos loci fueron tipificados mediante el uso de enzimas de restricción, enzimas que cortan el ADN en secuencias específicas de nucleótidos, para liberar fragmentos de diferentes longitudes basados en el número de iteraciones de la secuencia repetida entre las secuencias de reconocimiento de enzimas. En aquellos primeros días de identificación del ADN, los fragmentos fueron separados en geles de agarosa y los fragmentos específicos conteniendo STRs de interés identificados utilizando sondas de ADN radiactivo. Este fue un proceso complejo y lento, y desde la primera descripción del perfil de ADN y la determinación de la identidad una serie de mejoras y desarrollos han impactado de manera espectacular en el perfeccionamiento de la metodología y por lo tanto en la facilidad de análisis, y por tanto en el número de muestras que pueden ser procesadas así como en la energía y el coste discriminatorios. [0005] En la forma más corriente del método, se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los loci STR que luego son separados por una técnica tal como la electroforesis capilar (CE) . En el Reino Unido, cientos de miles de muestras se procesan anualmente que van desde raspados bucales de rutina a muestras del lugar de los hechos en delitos graves para comparación con la base de datos nacional de ADN que actualmente tiene más de 2 millones de tales perfiles. [0006] A pesar de la capacidad de los laboratorios para generar perfiles a partir de muestras simples tales como muestras bucales en tan sólo un día de trabajo para los casos urgentes, resulta difícil imaginar cómo podría lograrse esto de forma rutinaria para todas las muestras. Además, si se tiene en cuenta el tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta su llegada al laboratorio, es evidente que la mayoría de los perfiles no se pueden determinar a tiempo. En consecuencia, un sospechoso bajo custodia a menudo debe ser liberado en ausencia de evidencias adicionales antes de que se pueda obtener un perfil de ADN mediante un análisis. La consecuencia de esto puede ser que un individuo, detenido por delitos relativamente leves y subsiguientemente liberado, puede después determinarse que era el autor de un delito grave, teniendo que ser detenido de nuevo si es que puede ser localizado. Esto no es sólo un proceso lento y costoso, sino que también existe el riesgo de que una persona pueda cometer delitos adicionalespotencialmente graves que hubieran sido totalmente evitables si el perfil genético

hubiera estado disponible mientras todavía estaba bajo custodia. [0007] En el actual método basado en la PCR que comprende extracción de ADN, amplificación de STR, separación y análisis por tamaños en base a CE, aspectos del proceso, costo y complejidad de los equipos utilizados significan que el perfil de STR está confinado principalmente al laboratorio especializado con la restricción consiguiente en los tiempos de respuesta que en última instancia se pueden lograr. Sin embargo, si el perfil llega a hacerse lo suficientemente rápido para que los resultados puedan obtenerse de forma rutinaria, mientras un individuo está todavía detenido, entonces se debe encontrar un modo mediante el cual se pueda realizar un análisis in situ. [0008] En otro análisis no forense de ADN un enfoque adecuado ha sido usar PCR homogénea en la que el ADN es a la vez amplificado y analizado en un solo tubo por simples cambios en la fluorescencia. Varias de estos sistemas de sondas basados en fluorescencia incluyendo sondas HyBeacon y TaqMan (revisado en WO 01/73118 y WO 2007/010268) se han utilizado para determinar variaciones en secuencia del ADN tal como inserciones y supresiones de polimorfismos de nucleótido único (SNPs) . Sin embargo, tales sondas no se han utilizado para determinar polimorfismos de longitud más larga como se requiere para STR u otro análisis de la secuencia de ADN ni tampoco es obvio cómo polimorfismos de tal longitud podrían ser determinados usando sistemas de sonda homogéneos. [0009] Varios grupos han descrito sistemas de sonda homogénea permitiendo el análisis de los productos de PCR en un solo tubo utilizando por ejemplo el ciclo en el que la amplificación es lo primero que se detecta con el fin de proporcionar una cuantificación relativa de una secuencia de ADN dentro de otra, como por ejemplo para mezclas de especies animales en el análisis de alimentos, o de una variante alélica dentro de otra, como por ejemplo un análisis genotípico y estado de portador con respecto a un polimorfismo de nucleótido simple o SNP. Hemos descrito previamente el nuevos sistemas de sonda fluorescente, HyBeacons, que pueden identificar diferencias sutiles en la secuencia tales como SNPs o pequeñas inserciones o supresiones, debido a su gran influencia sobre la temperatura de fusión y la nueva naturaleza de la estructura de HyBeacons que permite que esto se logre. Estos enfoques podrían ser utilizados para identificar a los individuos por perfiles SNP en formato homogéneo y potencialmente portátil. Sin embargo, las bases de datos existentes se basan actualmente en STRs que, debido a la naturaleza mucho más variable de los STRs cuya media en la región de 10 alelos por locus, en comparación con los SNPs que por lo general sólo tienen dos alelos por locus. En consecuencia, el estándar de la industria en el Reino Unido de perfilado forense de ADN es el kit SGM+ de Applied Biosystems que comprende 10 STRs y un test de género con preferencia a los paneles de tipificación de SNP que requerirían del orden de 50-100 SNPs para alcanzar niveles comparativos de discriminación individual. Por supuesto, mientras que un panel SNP se podría utilizar para la comparación de muestras individuales actualmente sólo hay una base de datos basada en STR con la cual se puedan comparar muestras individuales. [0010] En un intento de posibilitar que el tipado STR sea aplicado en entornos fuera de un laboratorio especializado, se han hecho esfuerzos para combinar varios pasos del método estándar de identificación de perfiles en un formato homogéneo utilizando CE en miniatura. La mayor ventaja de estos sistemas en miniatura es que cuanto más corto es el capilar más rápido es el análisis. Estos capilares son a menudo grabados en el portaobjetos de un microscopio y tienen generalmente 10-50 IJm de profundidad por 50 IJm de ancho con una longitud de pocos centímetros y sellados con un cubreobjetos de vidrio (Wooley y Mathies, 1994) . Se han descrito formatos alternativos también como el plástico moldeado por inyección (McCormick et al, 1997) . [0011] Las columnas CE miniaturizadas con una longitud de unos pocos centímetros, en contraste con los sistemas ABI más comunes con una columna de 36 cm de longitud, pueden reducir los tiempos de separación de unos 45 minutos a tan sólo 2, 5 minutos para el kit Promega PowerPlex™ 1.1 STR (Schmalzing et al, 1999) . También se han descrito sistemas de conjuntos capilares que pueden analizar hasta 96 muestras simultáneamente en tan sólo dos minutos (Shi et al, 1999) y, más recientemente,... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar simultáneamente el número de repeticiones en tándem en polinucleótidos diana en un locus polimórfico dado del que se sabe que tiene múltiples alelos que varían en el número de repeticiones en tándem, el método comprendiendo:

(a) proporcionar una muestra que contiene los polinucleótidos diana, donde dos o más de las repeticiones en tándem en los polinucleótidos diana se encuentran en forma de cadena simple,

(a1) hibridar un oligonucleótido de bloqueo a por lo menos una pero no todas las repeticiones en tándem en los polinucleótidos diana proporcionados en el paso (a) para que una o más de las repeticiones en tándem en los polinucleótidos diana permanezca en forma de cadena simple después de la hibridación de los oligonucleótidos de bloqueo,

(b) la hibridar un oligonucleótido sonda etiquetado con la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana, donde el oligonucleótido sonda es complementario de al menos una de las repeticiones en tándem, y al menos 5 nucleótidos del oligonucleótido sonda son complementarios de las repeticiones en tándem, en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana, en donde el oligonucleótido sonda es uno que permite la discriminación entre diferentes números de repeticiones en tándem en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana de acuerdo a su temperatura de fusión (Tm) , y donde el oligonucleótido sonda es total o parcialmente complementario de al menos una repetición en tándem en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana.

(c) determinar simultáneamente el número de repeticiones en tándem en los polinucleótidos diana en base a la hibridación del oligonucleótido sonda a la porción de cadena simple de los polinucleótidos diana y su temperatura de fusión.

2. Un método de acuerdo a la Reivindicación 1, donde el polinucleótido diana es ADN.

3. Un método de acuerdo a la Reivindicación 1, donde la determinación en el paso (c) hace uso de análisis de la curva de fusión.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 donde en el paso (a) tres

o más de las repeticiones en tándem en los polinucleótidos diana están en forma de cadena simple.

5. Un método de acuerdo con las Reivindicaciones 3 ó 4, donde en el paso (b) el oligonucleótido sonda es complementario de al menos dos de las repeticiones en tándem de la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana, tal como al menos tres de las repeticiones en tándem en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, donde en el paso

(a) la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana que contienen repeticiones en tándem contiene al menos 8 nucleótidos; tal como al menos 16 nucleótidos.

7. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, donde en el paso (a1) el oligonucleótido de bloqueo hibrida con al menos dos de las repeticiones en tándem en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana, tal como con al menos tres de las repeticiones en tándem en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana.

8. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, donde en el paso (a 1) dos o más de las repeticiones en tándem permanecen en forma de cadena simple después de la hibridación del oligonucleótido de bloqueo, tal como tres o más de las repeticiones en tándem permanecen en forma de cadena simple después de la hibridación del oligonucleótido de bloqueo.

9. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, donde en el paso (a1) dos o más oligonucleótidos de bloqueo se hibridan con al menos una pero no con todas las repeticiones en tándem proporcionadas en el paso (a) de forma que una o más de las repeticiones en tándem en los polinucleótidos diana permanezca en forma de cadena simple después de la hibridación de los oligonucleótidos de bloqueo.

10. Un método de acuerdo con la Reivindicación 9, donde uno o más de los oligonucleótidos de bloqueo se hibridan a un número parcial de repeticiones en tándem.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la muestra en el paso (a) es producida durante o después de una reacción de amplificación, como una PCR.

12. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el oligonucleótido sonda está marcado con fluorescencia.

13. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que el oligonucleótido de bloqueo es totalmente complementario a la al menos una repetición en tándem en los polinucleótidos diana,

o en el que el oligonucleótido de bloqueo es parCialmente complementario a la al menos una repetición en tándem en los polinucleótidos de diana.

14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en el paso (a) una o ambas regiones que flanquean la repetición en tándem en los polinucleótidos diana está en forma de cadena simple.

1S. Un método de acuerdo con la Reivindicación 14 en el que el oligonucleótido sonda en el paso (b) contiene una parte de anclaje que es complementaria a una región en los polinucleótidos diana que flanquea la repetición en tándem.

16. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que en el paso (a) una o ambas regiones que flanquean la repetición en tándem en los polinucleótidos diana está en forma de cadena simple, y el oligonucleótido de bloqueo contiene una parte de anclaje que es complementaria a la región que flanquea la repetición en tándem.

17. Un método de acuerdo con la Reivindicación 16 en donde el oligonucleótido sonda en el paso

(b) contiene una parte de anclaje que es complementaria a la región que flanquea la repetición en tándem que no es complementaria a la parte de anclaje del oligonucleótido de bloqueo.

18. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, donde el oligonucleótido bloqueo contiene en su extremo 3' (o S') una parte de enganche que es complementaria a una parte de enganche en el extremo S' (o 3') del oligonucleótido sonda, y donde se usan al menos dos pares diferentes de oligonucleótido de bloqueo y oligonucleótido sonda en los cuales las partes de enganche respectivas de cada par de oligonucleótido de bloqueo y oligonucleótido sonda son complementarios entre sí.

19. Un método de acuerdo con la Reivindicación 18 donde la secuencia de nucleótidos de la parte de enganche se selecciona de manera que cada par de regiones de enganche complementarias tiene una Tm diferente.

20. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1 en el que los pasos (a) y (a1) se llevan a cabo de forma simultánea.

21. Un método de acuerdo con la Reivindicación 20 en el que una PCR genera el ADN diana (polinucleótido) , en el que una o más de las repeticiones en tándem en el ADN diana está en forma de cadena simple, y un cebador utilizado en la PCR comprende también el oligonucleótido de bloqueo.

22. Un método de acuerdo con la Reivindicación 21 en el que el cebador contiene en su extremo 3' una parte que es complementaria a una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem y en su extremo 5' una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto de PCR sintetizada por dicho cebador.

23. Un método de acuerdo con la Reivindicación 22 donde el cebador comprende, de 3 'a 5', (i) una parte que es complementaria a una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem, (ii) opcionalmente, una parte espaciadora, (iii) una parte de anclaje que es complementaria a una región que flanquea la repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador, y (iv) una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador.

24. Un método de acuerdo con la Reivindicación 23 en el que el cebador comprende además (v) una parte de enganche que es complementaria a una parte de enganche en el extremo 3' del oligonucleótido sonda.

25. Un método de acuerdo con la Reivindicación 23 en el que al menos se utilizan dos pares diferentes de cebador PCR y oligonucleótido sonda en los cuales las partes de enganche respectivas de cada par de oligonucleótido de bloqueo y oligonucleótido sonda son complementarias entre sí.

26. Un método de acuerdo con la Reivindicación 21 en el que el iniciador de la PCR también comprende el oligonucleótido sonda.

27. Un método según la Reivindicación 23 en el que el cebador comprende además (v) una parte espaciadora y (vi) un oligonucleótido sonda.

28. Un método según la Reivindicación 1, en el que la diferencia en la temperatura de fusión (llTm) entre la Tm de los híbridos formados entre el oligonucleótido sonda y la parte de cadena simple del ADN diana que contiene las repeticiones en tándem es al menos 0.5 oC.

29. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el paso de hibridación (b) se realiza a una temperatura predeterminada cerca de, o en un intervalo de temperaturas que abarca los puntos de fusión del híbrido o de los híbridos formados entre la parte de cadena simple del polinucleótido diana y el oligonucleótido sonda.

30. Un sistema para determinar simultáneamente el número de repeticiones en tándem en

polinucleótidos diana en un determinado locus polimórfico que se sabe que tiene alelos múltiples que varían en el número de repeticiones en tándem donde una o más de las repeticiones en tándem de los polinucleótidos diana se encuentra en forma de cadena simple, el sistema comprendiendo,

(a) una sonda de oligonucleótidos etiquetada que es complementaria de al menos una de las repeticiones en tándem, y al menos 5 nucleótidos del oligonucleótido sonda son complementarios de las repeticiones en tándem, en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana, en el que el oligonucleótido sonda se selecciona para permitir la discriminación entre diferentes números de repeticiones en tándem en la parte de cadena simple de los polinucleótidos diana según su temperatura de fusión (Tm)

(b) un oligonucleótido de bloqueo que es complementario a al menos una pero no todas las repeticiones en tándem en elpolinucleótido diana, y

(c) instrumento para la determinación de la temperatura de fusión.

31. Un cebador de oligonucleótido para participar en una reacción PCR para amplificar un ADN diana que contiene repeticiones en tándem que comprenden, de 3' a 5', (i) una parte que es complementaria a una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem (ii) opcionalmente, una parte espaciadora, (iii) una parte de anclaje, que es complementaria a una región que flanquea las repeticiones en tándem en la cadena del producto PCR sintetizada por dicho cebador, y (iv) una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador.

32. Un cebador de oligonucleótido según la Reivindicación 31 que comprende además (v) una parte espaciadora y (vi) un oligonucleótido sonda.

33. Un sistema para determinar el número de repeticiones en tándem en un polinucleótido diana, el sistema comprendiendo un oligonucleótido que está etiquetado comprendiendo una parte que contiene al menos dos repeticiones en tándem unida a una parte de anclaje, en el que la secuencia de la parte de anclaje y las al menos dos repeticiones en tándem se produce de forma contigua en un polinucleótido diana y un oligonucleótido según la Reivindicación 31.

34. Un sistema para determinar el número de repeticiones en tándem en un polinucleótido diana, el sistema comprendiendo un oligonucleótido que está etiquetado comprendiendo una parte que contiene al menos dos repeticiones en tándem unida a una parte de anclaje, en el que la secuencia de la parte de anclaje y las al menos dos repeticiones en tándem se produce de forma contigua en un polinucleótido diana que además comprende en su extremo 3' una parte de enganche y un cebador de oligonucleótido según la Reivindicación 31 y que comprende además

(v) una porción de enganche en la que dichas partes de enganche son complementarias entre sí.

35. Un sistema para determinar el número de repeticiones en tándem en un polinucleótido diana que comprende dos o más pares de oligonucleótidos según la Reivindicación 34, donde dichos pares de oligonucleótidos tienen partes de enganche complementarias.

36. Un método para la preparación de un cebador de oligonucleótidbpara participar en una reacción PCR para amplificar un ADN diana que contiene repeticiones en tándem de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 31 y 32, comprendiendo el método:

(a) seleccionar un ADN diana que contiene repeticiones en tándem,

(b) obtener la secuencia de las repeticiones en tándem y la secuencia de una o más de las regiones flanqueantes,

(c) sintetizar un oligonucleótido que comprende, de 3' a 5', (i) una parte que es complementaria a una región en el ADN diana que es 3' de las repeticiones en tándem (ii) opcionalmente, una 5 parte espaciadora, (iii) una parte de anclaje que es complementaria a una región que flanquea la repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador, (iv) una parte que es complementaria de al menos una repetición en tándem en la cadena del producto PCR sintetizado por dicho cebador y, opcionalmente, (v) una parte de enganche que es complementaria a la parte de enganche en el extremo 5' (o 3') del oligonucleótido sonda u,

opcionalmente, (v) una parte espaciadora y (vi) un oligonucleótido sonda.

37. Un método para preparar un sistema de acuerdo con la Reivindicación 33, que comprende:

(a) seleccionar un ADN diana que contiene repeticiones en tándem,

(b) obtener la secuencia de las repeticiones en tándem y la secuencia de una o más de las regiones flanqueantes,

(c) preparar dichos oligonucleótidos.

38. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 29 o 36 o 37, o un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30 o 33 a 35 o un oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 31 y 32 donde el ADN diana es ADN genómico humano.