Nuevos métodos y kits relacionados con la detección, la identificación y la cuantificación de levaduras en vino, cerveza y zumos.

Un método para detectar e identificar organismos de levadura en bebidas alcohólicas y no alcohólicas,

quecomprende:

- extraer una muestra de ADN a partir de una muestra de bebida;

- poner en contacto la muestra de ADN con una pareja de cebadores de ADN y una sonda de ADN, quecomprenden moléculas de cebadores de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos del gen deactina o de homólogos del mismo;

- proporcionar una condición para la reacción de amplificación del ácido nucleico que permite la realización dedicha amplificación del ácido nucleico, produciendo de este modo una molécula de amplicón de ADN;

- detectar la molécula de amplicón;

caracterizado porque las secuencias de los cebadores y la secuencia de la sonda se seleccionan entre una de lassiguientes combinaciones:

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 2 y 4 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 3 para detectar Dekkerabruxellensis;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 6 y 8 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 7 para detectar Dekkerabruxellensis;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 10 y 12 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 11 para detectarHanseniaspora uvarum;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 14 y 16 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 15 para detectarHanseniaspora uvarum;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 10 y TGAAGATTGAGCAGCAGTTTCC y secuencia de sonda SEQ IDNO: 11 para detectar Hanseniaspora uvarum.

Nuevos métodos y kits relacionados con la detección, la identificación y la cuantificación de levaduras en vino, cerveza y zumos La invención se refiere a nuevos métodos analíticos para detectar e identificar contaminaciones por levaduras,

preferiblemente las de muestras de alimentos y bebidas descompuestas. Además, la invención describe nuevos métodos analíticos para detectar e identificar un organismo de levadura deseado que aparece en bebidas alcohólicas y no alcohólicas. La invención también incluye kits de prueba.

Los nuevos métodos analíticos de la invención y los kits de prueba detectan cualitativa y cuantitativamente e identifican una contaminación microbiana y microorganismos deseados utilizando secuencias de ADN específicas,

que indican gérmenes vivos y muertos en 12 horas. El ADN se amplifica y se cuantifica como tal. Esos métodos, siendo inventivos reemplazarán métodos analíticos convencionales como los métodos de cultivo y de microscopía, GC-MS o las denominadas pruebas de detección rápida, descritas más adelante.

Es bien sabido que la fabricación de alimentos y bebidas requiere un control ambiental muy estricto de los alimentos de partida, intermedios y finales, en tanto a su calidad química, física en todos los aspectos microbiológicos. De lo contrario, se pueden presentar carencias sensoriales y podrían causar pérdidas económicas graves.

Técnica anterior

La determinación de gérmenes, microorganismos deseados y no deseados, a través de la microscopía tenía lugar después del cultivo en medios adecuados y mediante un recuento microscópico convencional de los gérmenes. El uso de la microscopía permite distinguir entre microorganismos y turbidez (por ejemplo, un agente de curtido) , una 20 identificación morfológica del microorganismo y una estimación aproximada de los microorganismos vivos y muertos.

Este método se conoce desde hace mucho tiempo y está muy bien descrito en la bibliografía, pero tiene algunas desventajas tales como la falta de precisión, un alto grado de procedimientos realizados manualmente que son difíciles de automatizar. Además el límite es de hasta 10.000 gérmenes/ml.

Un método microbiológico alternativo para la determinación específica de gérmenes se basa en el crecimiento de esos gérmenes en medios específicos y la posterior determinación de los microorganismos a través de microscopía. Los métodos de este tipo están disponibles comercialmente. Sin embargo, la aplicación del método específico tiene sustancialmente las mismas desventajas que el método descrito anteriormente para el recuento total de las células viables. Una desventaja adicional es el largo tiempo de incubación, de al menos 48 horas.

Otro método para determinar gérmenes se basa en reacciones bioquímicas después del cultivo en medios 30 adecuados y el recuento total viable de microorganismos deseados y no deseados.

Las reacciones bioquímicas (como por ejemplo, la prueba API de Biomerieux) permiten distinguir entre diferentes microorganismos. Este método bien conocido tiene el inconveniente de que es necesaria una gran cantidad de procedimientos realizados manualmente, que son difíciles de automatizar. Además no es posible una identificación clara de un microorganismo en una mezcla de diferentes microorganismos y no se puede utilizar como un ensayo cuantitativo.

Una detección adicional de algunos microorganismos puede tener lugar mediante GC/MS o LC/MS empleando algunos metabolitos secundarios que son sintetizados por microorganismos particulares. Tales metabolitos se pueden detectar usando una separación cromatográfica y una determinación posterior usando, por ejemplo, espectrometría de masas o detección espectrofotométrica.

Un ejemplo importante en la industria productora de vino es, por ejemplo, la detección repetitiva de los metabolitos secundarios 4-etilfenol y 4-etil-guayacol, que sirve como un indicador de la presencia de Dekkera bruxellensis. Como ya se ha mencionado anteriormente, la detección empleando GC/MS o LC/MS es un método bastante costoso. La detección empleando metabolitos secundarios no se puede asignar a un único microorganismo. Además, la producción de metabolitos secundarios depende mucho de las condiciones ambientales y, por lo tanto, no es 45 realmente adecuada para una determinación cuantitativa.

La nueva tecnología de PCR (para uso cualitativo) en si misma se basa en la presencia de ADN. El ADN ya existe en forma de cadenas sencillas o la hélice de ADN se divide en cadenas sencillas. Dos cebadores oligonucleótidos se añaden en exceso. Se fijan sobre una parte específica del ADN no muy separada una de otra y en presencia de un agente iniciador de la polimerización de nucleótidos (polimerasa) , el segmento específico definido entre los 50 cebadores, se replica. Cuando se parte de una sola hélice de ADN, es decir, de dos cadenas, después de la polimerización se forman dos nuevas hélices, es decir, cuatro cadenas de composición idéntica. A continuación, se pueden utilizar para que se repliquen en otro ciclo. Si estas etapas se repiten, conducen a un aumento exponencial de la presencia de este segmento específico de ADN.

El método de la PCR cuantitativa es una metodología mejorada basada en la creación de una sonda de oligonucleótido que se ajusta entre los dos cebadores y se mantiene en el segmento que se va a replicar. Esta metodología se basa en la tecnología TaqMan®, que se basa en el ensayo de PCR con nucleasa 5', publicado en 1991 por Holland et al., aprovechando la actividad nucleasa 5' de la TaqPolimerasa y la aplicación de sondas marcadas con fluorescencia, específicas de secuencias.

Estas sondas se marcan en el extremo 5’-terminal con un agente fluorescente (informador) y en el extremo 3'terminal con un desactivador de la fluorescencia (desactivador) .

Como el espacio entre ambos está restringido, la fluorescencia emitida por el informador se inactiva mediante el desactivador (o el desactivador oscuro) por lo que no se puede observar fluorescencia. Durante la reacción en cadena inducida por la polimerasa, tanto el informador como el desactivador o el desactivador oscuro, respectivamente, se liberan de sus posiciones y ya no están muy cerca, pero están en solución. En estas circunstancias, se puede registrar una fluorescencia resultante del informador. Cuantas más moléculas informadoras se liberen mayor será la intensidad de la señal fluorescente. La cantidad de señal fluorescente es proporcional a la cantidad de secuencias replicadas. Mediante un análisis de las cinéticas, es decir, el número de ciclos necesario para obtener una cierta señal, se puede calcular el número inicial de copias de esa secuencia.

Este método es extremadamente sensible ya que replica las secuencias presentes y por lo tanto intensifica la señal que se va a registrar con cada ciclo. Hay muchas moléculas que muestran fluorescencia en diferentes condiciones, lo que permite diseñar patrones internos que controlan el éxito de cada replicación. Además, es posible someter a ensayo la presencia de diferentes secuencias en paralelo, usando diferentes longitudes de onda para detectar la fluorescencia resultante de cada una.

La optimización de las parejas de cebador y la sonda y de las condiciones de reacción variables del método de la PCR, es esencial. La tecnología de la PCR se ejecuta de forma correspondiente a los métodos descritos en los documentos USP 4.683.195, USP 4.683.202 y USP 4.800.159.

El documento USP 4.683.195 se dirige a un procedimiento para amplificar y detectar cualquier ácido nucleico diana contenido en un ácido nucleico o una mezcla de los mismos. El procedimiento comprende tratar hebras complementarias distintas de ácido nucleico con un exceso molar de dos cebadores de oligonucleótidos, extender los cebadores para formar productos complementarios de la extensión del cebador que actúan como moldes para sintetizar la secuencia de ácido nucleico deseada, y detectar la secuencia así amplificada. Las etapas de la reacción pueden llevarse a cabo de forma escalonada o simultáneamente y se pueden repetir tantas veces como se desee.

El documento USP 4.683.202 se refiere a un procedimiento para amplificar cualquier secuencia de ácido nucleico específica deseada, contenida en el ácido nucleico o una mezcla de las mismas.

El procedimiento comprende tratar hebras complementarias distintas de ácido nucleico con un exceso molar de dos cebadores de oligonucleótidos, y extender los cebadores para formar productos complementarios de extensión del cebador que actúan como moldes para sintetizar la secuencia de ácido nucleico deseada. Las etapas de la reacción pueden llevarse... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar e identificar organismos de levadura en bebidas alcohólicas y no alcohólicas, que comprende:

- extraer una muestra de ADN a partir de una muestra de bebida;

- poner en contacto la muestra de ADN con una pareja de cebadores de ADN y una sonda de ADN, que comprenden moléculas de cebadores de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos del gen de actina o de homólogos del mismo;

- proporcionar una condición para la reacción de amplificación del ácido nucleico que permite la realización de dicha amplificación del ácido nucleico, produciendo de este modo una molécula de amplicón de ADN;

- detectar la molécula de amplicón;

caracterizado porque las secuencias de los cebadores y la secuencia de la sonda se seleccionan entre una de las siguientes combinaciones:

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 2 y 4 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 3 para detectar Dekkera bruxellensis;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 6 y 8 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 7 para detectar Dekkera bruxellensis;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 10 y 12 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 11 para detectar Hanseniaspora uvarum;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 14 y 16 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 15 para detectar 20 Hanseniaspora uvarum;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 10 y TGAAGATTGAGCAGCAGTTTCC y secuencia de sonda SEQ ID NO: 11 para detectar Hanseniaspora uvarum.

2. El método según la reivindicación 1, en donde el número de organismos de levadura que estaban presentes en la muestra de bebida se determina basándose en la cantidad de moléculas de amplicón de ADN producidas, y en 25 donde la cantidad de moléculas de amplicón de ADN se determina mediante PCR fluorescente cuantitativa.

3. El método según la reivindicación 2, en donde el número de organismos de levadura que estaban presentes en la muestra de bebida se determina basándose en el número de ciclos de replicación durante la reacción de amplificación del ácido nucleico que son necesarios para obtener una cierta señal fluorescente.

4. Un método para la detección y la identificación de una molécula de ADN seleccionada a partir del gen de 30 actina o de homólogos del mismo de organismos de levadura en una muestra de ADN, comprendiendo el método:

- extraer una muestra de ADN a partir de una muestra de bebida;

- poner en contacto la muestra de ADN con una pareja de cebadores de ADN y una sonda de ADN, que comprenden moléculas de cebadores de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos del gen de actina o de homólogos del mismo;

- proporcionar una condición para la reacción de amplificación del ácido nucleico que permite la realización de dicha amplificación del ácido nucleico, produciendo de este modo una molécula de amplicón de ADN;

- detectar la molécula de amplicón;

caracterizado porque las secuencias de los cebadores y la secuencia de la sonda se seleccionan a partir de al menos una de las siguientes combinaciones:

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 2 y 4 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 3 para detectar Dekkera bruxellensis;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 6 y 8 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 7 para detectar Dekkera bruxellensis;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 10 y 12 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 11 para detectar 45 Hanseniaspora uvarum;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 14 y 16 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 15 para detectar Hanseniaspora uvarum;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 10 y TGAAGATTGAGCAGCAGTTTCC y secuencia de sonda SEQ ID NO: 11 para detectar Hanseniaspora uvarum.

5. El método según la reivindicación 4, en donde el número de moléculas de ADN que estaban presentes en la muestra de bebida se determina basándose en la cantidad de moléculas de amplicón de ADN producidas, y en 5 donde la cantidad de moléculas de amplicón de ADN se determina mediante PCR fluorescente cuantitativa.

6. El método según la reivindicación 5, en donde el número de moléculas de ADN que estaban presentes en la muestra de bebida se determina basándose en el número de ciclos de replicación durante la reacción de amplificación del ácido nucleico que son necesarios para obtener una cierta señal fluorescente.

7. Un kit de prueba para detectar e identificar contaminaciones por levadura en bebidas alcohólicas y no

alcohólicas, que comprende al menos una de las siguientes combinaciones de cebadores y sondas específicas para un gen diana de un contaminante de levadura:

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 2 y 4 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 3 para detectar Dekkera bruxellensis;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 6 y 8 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 7 para detectar Dekkera 15 bruxellensis;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 10 y 12 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 11 para detectar Hanseniaspora uvarum;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 14 y 16 y secuencia de sonda SEQ ID NO: 15 para detectar Hanseniaspora uvarum;

- secuencia de cebador SEQ ID NO: 10 y TGAAGATTGAGCAGCAGTTTCC y secuencia de sonda SEQ ID NO: 11 para detectar Hanseniaspora uvarum.

8. El kit de prueba según la reivindicación 7, caracterizado porque el kit de prueba está destinado al empleo en una tecnología de PCR fluorescente.

9. Uso de un kit según la reivindicación 7 u 8, para detectar e identificar organismos de levadura en bebidas 25 alcohólicas y no alcohólicas.

10. Un método para la detección y la identificación de organismos en bebidas alcohólicas y no alcohólicas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, utilizando un kit de prueba según la reivindicación 7 u 8.