Nuevos marcadores para el cáncer.

Un para determinar si un individuo ha desarrollado, está desarrollando o está predispuesto a desarrollar cáncer,

o si un individuo está recayendo tras un tratamiento contra el cáncer, que comprende el siguiente paso:

a) determinar el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitiosCpG en una secuencia de ácido nucleico en la región promotora, primer exón o intrón, de al menos un gende una muestra, obtenida de dicho individuo, donde dicho gen es:

CNRIP1, p. ej., tal como lo identifica la identificación génica ensembl ENSG00000119865, identificaciónde entrada 25927, y donde dicha secuencia comprende una secuencia de ácido nucleico constituida porla SEQ ID NO:7.

Nuevos marcadores para el cáncer

Campo técnico de la invención La presente descripción se refiere a marcadores novedosos para la hipermetilación de promotores génicos en el cáncer. En concreto, la presente descripción se refiere a un método para determinar si se está desarrollando un tumor en el sistema aéreo-digestivo, o si un individuo está recayendo tras el tratamiento de un tumor de este tipo. Los métodos de la presente descripción comprenden la determinación del estado de metilación de los sitios CpG en la secuencia/región promotora de uno o más genes concretos. La descripción además se refiere a la utilización de genes metilados de este tipo y a kits de diagnóstico para la detección del cáncer.

Antecedentes de la invención La regulación epigenética alterada es tan común como las mutaciones génicas en el cáncer humano. Estos mecanismos conducen a cambios cuantitativos y cualitativos en la expresión génica que dan lugar a una ventaja en forma de crecimiento selectivo, la cual puede dar como resultado una transformación cancerosa. Las islas de CpG hipermetiladas de manera aberrante en el promotor génico asociado con la inactivación transcripcional se encuentran entre los cambios epigenéticos más frecuentes en el cáncer. Debido a que la detección precoz de la enfermedad puede dar como resultado un mejor desenlace clínico en la mayoría de los tipos de cáncer, la identificación de la metilación génica aberrante asociada al cáncer representa un biomarcador novedoso y prometedor. Para los diferentes tipos de cáncer del sistema aéreo-digestivo, incluido el cáncer colorrectal, los estudios iniciales han identificado la presencia de ADN metilado de manera aberrante en las heces y sangre del paciente. Los genes hipermetilados de manera aberrante muy frecuentemente en los tumores benignos y solo de manera ocasional en la mucosa normal serían buenos candidatos de biomarcadores diagnósticos debido al beneficio clínico potencial de la detección temprana de adenomas de riesgo alto así como los estadios de riesgo bajo de los carcinomas.

En general, sin embargo, la sensibilidad y especificidad de los marcadores precoces existentes para el cáncer en el sistema aéreo-digestivo siguen siendo poco satisfactorias y, hasta la fecha, tan solo unos pocos de los genes que, de hecho, se han cribado para analizar la metilación han mostrado una sensibilidad y especificidad razonablemente altas. Se ha detectado hipermetilación específica en VIM (vimentina) y SFRP2 tal como han publicado Muller et al. y Chen et al. y, recientemente, en un informe de Lind et al. se ha sugerido que ADAMTS1 y CRABP1 presentan una frecuencia elevada de hipermetilación asociada al cáncer en los tumores colorrectales mientras que la frecuencia de hipermetilación de NR3C1 era considerablemente menor. Lind et al. además identificaron 18 genes como posibles marcadores del cáncer colorrectal. En un estudio de Mori et al. se concluyó que la proteína MAL de diferenciación de los linfocitos T, uno de los 18 genes candidatos examinados por Lind et al., no sería un biomarcador diagnóstico apropiado para el cáncer del tracto aéreo-digestivo ya que la frecuencia de metilación de MAL es baja y se corresponde solamente con un 6% de metilación (2/34 muestras) . Los análisis adicionales de varios de los 18 genes candidatos llevados a cabo por los inventores no proporcionaron resultados alentadores: NDRG1 no se metiló en ninguna de las muestras analizadas, NR3C1 se metiló pero únicamente con una frecuencia muy baja y en el análisis subsiguiente de la secuencia de SDHA fue imposible confirmar la identidad de este gen, lo que lo convierte en un marcador inadecuado del desarrollo del cáncer.

Como conclusión, no existe ninguna indicación de que ninguno de los genes examinados por Lind et al. proporcionaría mejora alguna en la tecnología actual para la detección del cáncer. En consecuencia, se necesita un conjunto de genes en el cual cada gen se hipermetile con una especificidad y frecuencia elevadas en el cáncer. En concreto, se necesita un conjunto de genes que sea útil en las técnicas no invasivas, tales como las técnicas que implican el uso de muestras fecales, o en técnicas que se pueden utilizar con material de muestra que se obtiene fácilmente, tal como la sangre o la mucosidad. Este tipo de grupo de genes podría mejorar notablemente la posibilidad de una detección precoz de estos tipos de cáncer. El objetivo final sería desarrollar ensayos diagnósticos para determinar la hipermetilación únicamente en unos pocos, tales como 2 o 3, marcadores génicos de frecuencia elevada.

Por consiguiente, se desea la identificación de más genes en los cuales las islas de CpG en la región promotora estén hipermetiladas con una frecuencia elevada en los diferentes tipos de cáncer.

El documento WO2005/005601 presenta CNRIP1 asociado con el cáncer pero no como un marcador hipermetilado. Además, el documento refiere que CNRIP1 se presenta elevado en el cáncer.

El documento WO01/19845 presenta un método para diagnosticar cáncer determinando el estado metilado de FBN1.

Qunying et al. (Cancer Cell, vol 9, n.º 5, 2006, páginas 367-378) , Und et al. (Molecular Cancer, vol 4, n.º 1, 2005, página 8) y Chen et al. (JNCI J. Nat. Cancer Inst, vol 97, n.º 15, 2005, páginas 1124-1132) muestran que los eventos de metilación y expresión diferencial no siempre están relacionados.

Keshet et al. (Nature Genetics, vol 38, n.º 2, 2006, páginas 149-153) presenta anticuerpos para detectar islas de CpG metiladas.

Compendio de la invención La presente descripción se basa en la comprensión por parte de los inventores de que un subconjunto concreto de genes, los cuales Lind et al. identificaron como marcadores potenciales, contienen sitios CpG que se metilan con una frecuencia excepcionalmente elevada en el cáncer aéreo-digestivo.

Por lo tanto, es un objeto de la presente descripción proporcionar un conjunto de marcadores diagnósticos del cáncer, p. ej., cáncer en el sistema aéreo-digestivo, en concreto el cáncer de colon y el cáncer colorrectal. Este conjunto de marcadores resuelve los problemas relacionados con la baja especificidad y frecuencia de la metilación en la mayoría de los marcadores del cáncer conocidos.

En consecuencia, un aspecto de la invención se refiere a un método para determinar si un individuo ha desarrollado, está desarrollando o está predispuesto a desarrollar cáncer, o si un individuo está recayendo tras un tratamiento contra el cáncer, que comprende los siguientes pasos:

a) determinar el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG en una muestra de un individuo;

b) construir un gráfico del percentil del nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG de al menos un gen obtenido a partir de una muestra de una población sana;

c) construir una curva ROC (curva de eficacia diagnóstica) basándose en el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG determinados en la población sana y en el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG determinados en una población con cáncer;

d) seleccionar la combinación deseada de sensibilidad y especificidad a partir de la curva ROC;

e) determinar a partir del gráfico del percentil el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el 25 estado de metilación de los sitios CpG correspondientes a la especificidad escogida o determinada; y

f) predecir que el individuo probablemente padecerá cáncer, si el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG de dicho gen de la muestra es igual o superior a dicho nivel de metilación, número de sitios CpG metilados o estado de metilación de los sitios CpG correspondientes a la combinación deseada de sensibilidad/especificidad, y predecir si el individuo probablemente padecerá cáncer o no, si el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG de la muestra es menor que dicho nivel de metilación, número de sitios CpG metilados o estado de metilación de los sitios CpG correspondientes a la combinación deseada de sensibilidad/especificidad.

La presente descripción además se refiere a un kit diagnóstico para la determinación del cáncer que comprende uno o más oligonucleótidos que actúan de cebadores o uno o más conjuntos de oligonucleótidos que actúan de cebadores, donde cada uno de los cuales es complementario a una secuencia de ácido nucleico de los genes seleccionados... [Seguir leyendo]

1. Un para determinar si un individuo ha desarrollado, está desarrollando o está predispuesto a desarrollar cáncer,

o si un individuo está recayendo tras un tratamiento contra el cáncer, que comprende el siguiente paso:

a) determinar el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG en una secuencia de ácido nucleico en la región promotora, primer exón o intrón, de al menos un gen de una muestra, obtenida de dicho individuo, donde dicho gen es:

CNRIP1, p. ej., tal como lo identifica la identificación génica ensembl ENSG00000119865, identificación de entrada 25927, y donde dicha secuencia comprende una secuencia de ácido nucleico constituida por

la SEQ ID NO:7.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 para determinar si un individuo ha desarrollado, está desarrollando o está predispuesto a desarrollar o está recayendo tras un tratamiento contra el cáncer en el sistema aéreo-digestivo, que comprende los siguientes pasos:

a) determinar el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG en una secuencia de ácido nucleico en la región promotora, primer exón o intrón de CNRIP1 (p. ej., tal como lo identifica la identificación génica ensembl ENSG00000119865, identificación de entrada 25927, y donde dicha secuencia comprende una secuencia de ácido nucleico constituida por la SEQ ID NO.: 7, en una muestra obtenida a partir de dicho individuo,

b) comparar dicho nivel de metilación, el número de sitidos CpG metilados o el estado de metilación de los 20 sitios CpG respecto a una referencia; e c) identificar si es probable que el individuo desarrolle, esté desarrollando o esté predispuesto a desarrollar dicho cáncer, o esté recayendo tras el tratamiento contra dicho cáncer, si el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG son más elevados que los de la referencia e identificar si es poco probable que un individuo desarrolle, esté desarrollando o esté predispuesto a desarrollar dicho cáncer, o esté recayendo tras el tratamiento contra dicho cáncer, si el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG está por debajo de los de la referencia.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1-2, donde el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG se determina mediante secuenciación con bisulfito, reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación (MSP) cualitativa y/o cuantitativa, pirosecuenciación, transferencia de Southern, barrido del genoma de los puntos de referencia de restricción (RLGS) , extensión del cebador en un único nucleótido, micromatriz de islas de CpG, SNUPE, COBRA, espectrometría de masas, mediante la utilización de enzimas de restricción específicas de metilación, mediante la determinación del nivel de expresión de dichos genes o una combinación de estos.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicha PCR específica de metilación comprende la utilización de cebadores de ácidos nucleicos los cuales son capaces de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico que comprende 2 sitios CpG y un residuo de citosina el cual no está en un sitio CpG.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de la reivindicaciones precedentes, donde el cáncer del sistema aéreodigestivo se selecciona a partir del grupo constituido por: tumores colorrectales, tumores pulmonares, carcinoma microcítico de pulmón, carcinomas pulmonares no microcíticos, tumores esofágicos, tumores gástricos, tumores pancreáticos, tumores hepáticos, tumores de la vesícula biliar y/o del conducto biliar, tumores del intestino delgado y tumores del intestino grueso.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la muestra se obtiene a partir

de sangre, excrementos, orina, líquido pleural, bilis, líquido bronquial, enjuagues bucales, piezas histológicas, ascitis, 45 pus, líquido cefalorraquídeo, muestras obtenidas por aspiración, líquido folicular, tejido o moco.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG se combina con al menos un marcador adicional.

8. Un método para determinar si un individuo ha desarrollado, está desarrollando o está predispuesto a desarrollar o

está recayendo tras un tratamiento contra el cáncer en el sistema aéreo-digestivo, que comprende los siguientes pasos:

a) determinar el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios 70

CpG en una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo constituido por:

1) Una secuencia de ácido nucleico tal como la define la SEQ ID NO:7, 2) Una secuencia de ácido nucleico la cual es complementaria a una secuencia tal como se define en

1) ; 3) Una subsecuencia de una secuencia de ácido nucleico tal como se define en 1) o 2) ; 4) Una secuencia de ácido nucleico la cual es idéntica en al menos un 75% a una secuencia tal como se define en 1) , 2) o 3)

en una muestra obtenida de dicho individuo,

b) comparar dicho nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG respecto a una referencia; e c) identificar si es probable que dicho individuo desarrolle, esté desarrollando o esté predispuesto a desarrollar dicho cáncer, o esté recayendo tras el tratamiento contra dicho cáncer, si el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG son más elevados que los de la referencia e identificar si es poco probable que un individuo desarrolle, esté desarrollando o esté predispuesto a desarrollar dicho cáncer, o esté recayendo tras el tratamiento contra dicho cáncer, si el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG está por debajo del de la referencia.

9. La utilización de un CNRIP1 en un ensayo diagnóstico donde se evalúa el nivel de metilación, el número de sitios CpG metilados o el estado de metilación de los sitios CpG como un indicador de si el individuo ha desarrollado, está desarrollando o está predispuesto a desarrollar cáncer en el sistema aéreo-digestivo, o si un individuo está recayendo tras el tratamiento contra el cáncer en el sistema aéreo-digestivo.

FIG. 10