Mutantes de interferón alfa 2 (IFN alfa 2) recombinante.

Una molécula de ADN seleccionada entre el grupo que consiste en la SEC ID Nº 15 y la SEC ID Nº 18.

Campo de la invención La presente invención se refiere a mutantes de interferón !2 (IFN!2) recombinantes, que tienen actividad agonista o antagonista específica mejorada en comparación con IFN!2 de tipo silvestre, y a composiciones farmacéuticas de los mismos, útiles para tratar o prevenir el cáncer, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas y trastornos asociados con una expresión aumentada de IFN!2.

Antecedentes de la invención Los interferones (IFN) se descubrieron en 1957 por Isaacs y Lindenmann, y se nombraron por su capacidad de interferir con la proliferación viral. Los interferones también pueden combatir infecciones bacterianas y parasitarias, inhibir la división celular, inhibir la apoptosis espontánea, y promover o impedir la diferenciación de células. En base a su especificidad de receptor, se reconocen dos tipos de interferones: Tipo I y Tipo II. Los interferones de Tipo I son una familia de proteínas monoméricas que incluyen IFN! e IFN∀ que son productos de leucocitos, IFN# que se produce por fibroblastos, e IFN∃ que se ha descrito solamente en especies unguladas.

El único interferón de tipo II conocido es el IFN% dimérico, que se produce exclusivamente por linfocitos. La familia del interferón alfa está compuesta por 13 genes completamente traducidos sin intrones (excluyendo pseudogenes) . Cada miembro incluye proteínas maduras de 165 o 166 restos aminoacídicos, con dos enlaces disulfuro conservados: Cys1-Cys98 y Cys29-Cys138. Se presenta un elevado nivel de homología de secuencia (80%) entre los diversos subtipos de interferón alfa, y existe aproximadamente un 35% de homología entre estos subtipos y el IFN#. A pesar de la elevada homología de los diferentes subtipos, sus actividades biológicas, entre ellas las antiproliferativas, antivirales e inmunomodulación, difieren notablemente.

La estructura de varios interferones de tipo I se ha resuelto incluyendo IFN# murino (1IFA, 1RMI) , IFN# humano (1AU1) , IFN!2 humano (1RH2, 1ITF) , e IFN∃ ovino (1BSL) . Estructuralmente, los interferones son miembros de la familia de citoquinas de !-hélice. Todos los interferones de tipo I proporcionan señalización a través de un complejo receptor común compuesto por IFNAR1 e IFNAR2. El componente de unión a ligando principal del receptor de interferón tipo I es IFNAR2, con una afinidad de unión de & 10 nM para IFN!2. La estructura de la parte extracelular de IFNAR2 consiste en dos dominios tipo inmunoglobulina, estando localizado el sitio de unión de IFN!2 en el dominio N-terminal y el bucle de conexión.

IFNAR1 maduro es una proteína de 530 aminoácidos, con un segmento transmembrana compuesto por 21 restos, y un dominio citoplasmático de 100 restos. La estructura de la parte extracelular de IFNAR1 es desconocida, pero a partir de la secuencia se puede deducir que está compuesta por cuatro dominios tipo inmunoglobulina. La unión de IFN!2 a IFNAR1 es débil, siendo la afinidad medida en una membrana artificial de 1, 5-5 ∋M. IFNAR1 bovino (BoIFNAR1) e IFNAR1 humano (HuIFNAR1) son un 68% idéntico. Los subdominios 2 y 3 de HuIFNAR1 han demostrado desempeñar una tarea crítica en la unión a IFN!2. Intercambiando estos subdominios con BoIFNAR1 homólogo, la afinidad se aumentaba sustancialmente. El BoIFNAR1 soluble puede unirse a interferones humanos con una afinidad de 10 nM, que es 500 veces mayor que la de HuIFNAR1. Células murinas que expresan IFNAR2 se unen a IFN!2 con una afinidad 8 nM, mientras que células que expresan solamente IFNAR1 no muestran unión a ligando. Tras la co-expresión de IFNAR1 e IFNAR2, se observó un aumento de diez veces en la afinidad por IFN!2. Usando estudios in vitro sobre membranas artificiales se demostró que la magnitud del aumento inducido por IFNAR1 en la afinidad de unión del complejo ternario está relacionada con la concentración en superficie de este receptor. La localización del sitio de unión a IFNAR1 en el interferón se mapeó en IFN# localizado en las hélices B, C, y D y el bucle DE mientras que la mutagénesis por exploración con ala de IFN!2 ha sugerido que el sitio de unión a IFNAR1 está restringido a las hélices B y C.

Varios estudios han sugerido que la formación del complejo ternario sucede de un modo secuencial, comenzando con la unión al interferón de IFNAR2 para formar un complejo intermedio, y seguido por el reclutamiento de IFNAR1. El complejo IFNAR1-IFN#-IFNAR2 ha demostrado tener una estequiometría 1:1:1. El receptor IFNAR1 es un componente esencial del complejo receptor de interferón, provocando una mutación nula en IFNAR1, o la adición de Ab neutralizante contra este receptor en una ausencia completa de las respuestas antivirales y antiproliferativas para IFN! e IFN#. La asociación de IFNAR1 e IFNAR2, estimula la activación de las quinasas intracelulares asociadas de forma constitutiva Jak1 y Tyk2, que conduce a una cascada de fosforilación de tirosina que provoca la dimerización de los transductores de señales y activadores de la de la transcripción fosforilados (STAT) , y el transporte al núcleo, donde se unen a secuencias de ADN específicas y estimulan la transcripción de cientos de genes sensibles.

La cuestión sigue abierta sobre cómo IFN muy similares inducen diferentes actividades en el mismo tipo celular. Se ha sugerido que las actividades biológicas de diferentes subtipos de IFN! se correlacionan con sus respectivas

afinidades de unión y el tipo celular usado.

Los interferones de tipo I de vertebrados se reconocen por un único receptor compartido, compuesto por dos proteínas transmembrana (IFNAR1 e IFANR2) , presentan su actividad a través de sus Jak quinasas asociadas con los factores de transcripción Stat como sus dianas principales (Brierley, M. M. y Fish, E. N. 2002. J Interferon Cytokine Res. 22, 835-845) . Típicamente reconocidos por los plegamientos tipo IgG de sus dominios extracelulares (dominios hCR) , IFNAR2 e IFNAR1 se consideran respectivamente proteínas de unión y factores de transducción accesorios -es decir, las cadenas alfa y beta de receptores heteroméricos. Una diferencia en las constantes de disociación de ligando de las dos cadenas es implícita a la definición. No obstante, ambas contribuyen a la creación de sitios de unión de alta afinidad. La combinación de una cadena beta "común" con diferentes cadenas de reconocimiento es una característica de receptores heteroméricos que responden de forma diferente a diferentes ligandos. La capacidad de interaccionar con diferentes cadenas alfa establece conexiones de red potenciales para una expresión diferencial del receptor (Kotenko, S. V. y Langer, J. A. 2004. Int Immunopharmacol 4, 593-608) . Cuando, como IFNAR1, tienen la capacidad de interaccionar con elementos de diferentes vías de señalización, pueden establecer conexiones para una expresión génica diferencial (Platanias, L. C. y Fish, E. N. 1999. Experimental Hematology 27, 1583-1592) .

Las IFN humanas ascienden a 12 proteínas alfas distintas no alélicas, una beta y una omega. Como se espera de una familia con marcada homología de secuencia, una estructura central 3D compartida y un receptor compartido, las actividades de los IFN de Tipo I solapan. No obstante, pueden reconocerse e incluso clasificarse por sus diferencias de aminoácidos y se han observado numerosos casos de diferencias relativas en la actividad. La imagen emergente es que diferencias funcionales aparecen solamente en contextos fisiológicos específicos. Además de su acción local para conferir protección antiviral en casi cualquier célula, están ligadas al desarrollo de las defensas antivirales de segunda línea. Se observó que una posible diferencia entre los IFN podría ser su potencial de unirse fuertemente a IFNAR1 (Roisman et al., 2005. J Mol Biol. 353, 271-281) .

Las actividades diferenciales de los IFN de Tipo 1 ha sido objeto de intensas investigaciones durante muchos años. Particularmente, se observó que IFN# tiene un repertorio adicional de actividades sobre IFN!. Un análisis detallado de las diferencias entre estos dos IFN ha demostrado que IFN# tiene una actividad general mayor en la activación de la transcripción de genes sensibles a IFN, y es activo a niveles reducidos de IFN. Estudios de unión sugirieron que la afinidad hacia la subunidad accesoria IFNAR1 es la diferencia clave entre IFN!2 e IFN# (Jaitin, 2006. Mol Cell Biol. 26, 1888-1897) .

Se sabe que IFN!2 tiene efectos anti neoplásicos. Sin embargo, este tratamiento no siempre es eficaz y a veces provoca efectos secundarios intolerables relacionados con la dosificación y duración de la terapia. El documento WO 97/12630 desvela el tratamiento de pacientes con cáncer con temozolomida en combinación con IFN!2. El documento WO 01/54678 desvela el tratamiento... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ADN seleccionada entre el grupo que consiste en la SEC ID Nº 15 y la SEC ID Nº 18.

2. El polipéptido mutante de interferón !2 (IFN!2) codificado por una molécula de ADN de la reivindicación 1.

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho polipéptido está adicionalmente conjugado con PEG.

4. Un vector que comprende la molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, unida de forma funcional a uno

o más elementos de control de la transcripción.

5. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 4.

6. Una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, que opcionalmente comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3 para su uso como agente terapéutico.

8. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer, donde dicho cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en leucemia de células capilares, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, leucemia mielogénica crónica, linfoma no Hodgkin y melanoma.

9. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, donde dicho cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en leucemia de células capilares, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, leucemia mielogénica crónica, linfoma no Hodgkin y melanoma.

10. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3 para la preparación de un medicamento para el 30 tratamiento o prevención de esclerosis múltiple (MS) .

11. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3 para su uso en el tratamiento o prevención de esclerosis múltiple (MS) .

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 10 o el polipéptido para su uso en el tratamiento o prevención de esclerosis múltiple (MS) de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicha MS se selecciona entre el grupo que consiste en MS recidivante remitente, MS progresiva secundaria, MS progresiva primaria, y MS recidivante progresiva.

13. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de infección por virus de la hepatitis.

14. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3 para su uso en el tratamiento o prevención de infección por

virus de la hepatitis. 45

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 13 o el polipéptido para su uso en el tratamiento o prevención de infección por virus de la hepatitis de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicho virus de la hepatitis se selecciona entre el grupo que consiste en hepatitis A, hepatitis B y hepatitis C.