Mutantes de Interferón alfa 2 (IFN alfa 2) recombinante.

Una molécula de ADN seleccionada del grupo de las SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 21, SEC ID Nº 22 y SEC ID Nº 23.

Mutantes de Interferón alfa 2 (IFN alfa 2) recombinante

CAMPO DELA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a mutantes de interferón α2 (IFNα2) recombinante, con una actividad agonista específica mejorada en comparación con el IFNα2 de tipo salvaje, y con composiciones farmacéuticas de los mismos, útiles para el tratamiento o la prevención del cáncer, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas ytrastornos asociados al aumento de la expresión del IFNα2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En 1957, Isaacs y Lindenmann descubrieron los interferones (IFNs) , que reciben su nombre debido a su capacidad para interferir en la proliferación viral. Los interferones pueden también combatir las infecciones bacterianas y parasitarias, inhiben la división celular, inhiben la apoptosis espontánea y mejoran o impiden la diferenciación de las células. Se reconocen en base a su especificidad del receptor dos tipos de interferones: Tipo I y Tipo II. Los interferones de Tipo I son una familia de proteínas monoméricas que incluyen IFNα y IFNω que son productos de los leucocitos, el IFN -β es producido por fibroblastos y el IFN-τ se ha descrito sólo en especies de ungulados.

El único interferón conocido de Tipo II es el IFN-γ dimérico, producido exclusivamente por los linfocitos. La familia del interferón alfa se compone de 13 genes sin intrones traducidos completamente (excluyendo a los pseudogenes) . Cada miembro incluye proteínasmaduras de 165 o 166 residuos de aminoácidos con dos puentes de disulfuro conservado: Cysl1 - Cys98 y Cys29 - Cys138. Se muestra un nivel alto de las homologías de secuencias (80 %) entre diversos subtipos de interferón alfa, existiendo aproximadamente un 35 % de homología entre estos subtipos y el IFN -β. A pesar de la alta homología de los diferentes subtipos, sus actividades biológicas, entre ellas la actividad antiproliferativa, antiviral y la inmunomodulación, difieren especialmente.

Se ha resuelto la estructura de varios interferones de Tipo I incluyendo el IFNβ -murino (1IFA, 1RMI) , IFN β humano (1AU1) , IFN -α2 humano (1RH2, 1ITF) e IFN-τ ovino (1B5L) . Estructuralmente, los interferones son miembros de la familia de la citocina α - helicoidal. Todos los interferones de Tipo I se indican a través de un complejo receptor común compuesto por IFNAR1 e IFNAR2. El mayor componente de unión de ligando del receptor del interferón de Tipo I es IFNAR2, con una afinidad de unión de ~ 10 nM para el IFN -α2. La estructura de la parte extracelular del IFNAR2 se compone de dos dominios de tipo inmunoglobulina con un área de unión del IFN -α2 localizada en el extremo N-terminal y en el lazo de conexión.

El IFNAR1 maduro es una proteína de 530 aminoácidos con un segmento transmembrana compuesto por 21 residuos y un dominio citoplasmático de 21 residuos. Se desconoce la estructura de la parte extracelular de IFNAR1, pero desde la secuencia uno se puede deducir que se compone de cuatro dominios de tipo inmunoglobina. Es débil la unión del IFN -α2 con IFNAR1, siendo la afinidad medida en una membrana artificial de 1, 5-5 µM. Son idénticos un 68 % el IFNAR1 bovino (BoIFNAR1) y el IFNAR1 humano (HuLFNAR1) . Los subdominios 2 y 3 de HuIFNAR1 han demostrado que desempeñan un papel crítico en la unión del IFN -α2. Se incrementó sustancialmente la afinidad por el intercambio de estos subdominios con el BoIFNAR1 homólogo. El BoIFNAR1 soluble puede unirse a interferones humanos con una afinidad de 10 nM, 500 veces mayor que la del HuIFNAR1. Las células múridas que expresan IFNAR2 se unen al IFN -α2 con una afinidad de 8 nM, mientras que las células que sólo expresan IFNAR1no muestran unión al ligando. Tras la coexpresión de IFNAR1 e IFNAR2, se observó un incremento de 10 veces en la afinidad para el IFN -α2.

Utilizando estudios in vitro en membranas artificiales, se demostró que la magnitud del aumento inducido del IFNAR1 en la afinidad de unión del complejo ternario se refiere a la concentración superficial relativa de este receptor. La ubicación del área de unión del IFNAR1 en un interferónsemapeó enel IFN -β para ubicarse en las hélices B, C y D y en el lazo DE, mientras que la mutagénesis mediante Ala del IFN -α2 sugiere que el área de unión del IFNAR1 se limita a las hélices B y C.

Varios estudios sugieren que la formación del complejo ternario se produce en un modo secuencial, comenzando con la unión del interferón IFNAR2 para formar un complejo intermedio, seguido por el reclutamiento del IFNAR1. El complejo IFNAR1 – IFN –α - IFNAR2 ha mostrado tener una estequiometría de 1 :1 :1. El receptor IFNAR1 es un componente esencial del complejo receptor del interferón, con unamutación nula de un IFNAR1, o la adición del neutralizante Ab contra este receptor que da como resultado una falta completa de respuestas antivirales y antiproliferativas al IFN -α e IFN -β.

La asociación del IFNAR1 e IFNAR2 estimula la activación de las quinasas intracelulares constitutivamente asociadas a Jak1 y Tyk2, que conduce a una cascada de fosforilación de tirosina que es resultado de la dimerización de los transductores de señales y activadores de transcripción (STATs) , y el transporte al núcleo, donde se unen a secuencias específicas de ADN y estimulan la transcripción de cientos de genes receptivos.

El interrogante sigue siendo cómo los IFNsmuy similares inducen actividades diferenciales en el mismo tipo de células. Se ha sugerido que las actividades biológicas de los diferentes subtipos de IFN -α se correlacionan con sus respectivas afinidades de unión y el tipo celular utilizado.

Los interferones de Tipo I vertebrados son reconocidos por un solo receptor compartido, compuesto por dos proteínas transmembranales (IFNAR1 e IFNAR2) , que muestran su actividad a través de sus quinasas Jak asociadas con los factores de transcripción STAT como sus objetivos principales (Brierley, M.M. & Fish, E. N. 2002. J Interferon Cytokine Res. 22, 835 - 845) . Típicamente reconocidos por los plegamientos de inmunoglobulina de tipo G G de sus dominios extracelulares (dominios hCR) , el IFNAR2 e IFNAR1 son considerados respectivamente como proteínas de unión y factores de transducción accesorios; es decir, las cadenas alfa y beta de los receptores heteroméricos. Está implícita en la definición una diferencia en las constantes de disociación en el ligando de las dos cadenas. Sin embargo, ambas contribuyen a la creación de áreas de unión de alta afinidad. La combinación de una cadena beta “común” con cadenas de reconocimiento diferentes, es una característica de los receptores heteroméricos que responden demanera diferente a diferentes ligandos. La capacidad de interactuar con diferentes cadenas alfa, establece conexiones de red potenciales para la expresión del receptor diferencial (Kotenko, S. V. & Langer, J. A. 2004. Int Immunopharmacol 4, 593 - 608) . Cuando estas, al igual que IFNAR1, poseen la capacidad de interactuar con los elementos de las diferentes vías de señalización, pueden establecer conexiones para la expresión génica diferencial (Platanias, L. C. & Fish, E. N. 1999. Experimental Hematology 27, 1583 - 1592) .

Los IFNs humanos cuentan con 2 proteínas alfa no alélicas diferentes, una beta y una omega. Como era de esperar, en una familia con homología de secuencia marcada, una estructura de núcleo 3D compartida y un receptor compartido se superponen a las actividades de los IFNs de Tipo I. Sin embargo, pueden reconocerse e incluso clasificarse por sus diferencias en los aminoácidos y se han observado en los numerosos ejemplos de diferencias relativas en la actividad. La divulgación resultante es que las diferencias funcionales sólo aparecen en contextos fisiológicos específicos. Además de su acción local para conferir protección antiviral a casi cualquier célula, están relacionadas al desarrollo de la segunda línea de defensas antivirales. Se observó una posible diferencia entre los IFNs que podrían tener potencial para unirse fuertemente al IFNAR1 (Roisman et al, ; 2005. J Mol Biol. 353, 271 281) .

Durante varios años han sido objeto de intensas investigaciones las actividades diferenciales del los IFNs del Tipo I. En particular, se observó que el IFN -β tiene un repertorio adicional de actividades a través del IFN-α. El análisis detallado de las diferencias entre estos dos IFNs muestran que el IFN -β posee una mayor actividad general en la activación de la transcripción de los genes receptivos del IFN, y se activa para reducir los niveles del IFN. Los estudios de unión sugieren que la afinidad... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ADN seleccionada del grupo de las SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 21, SEC ID Nº 22 y SEC ID Nº

23.

2. El polipéptido del interferón α2 (IFN -α2) mutante codificado por una molécula de ADN de la reivindicación 1.

3. El polipéptido según la reivindicación 2, en el que dicho polipéptido es conjugado además con PEG.

4. Un vector que comprende la molécula de ADN según la reivindicación 1, operablemente unida a uno o más elementos de control de transcripción.

5. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 4.

6. Una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo un polipéptido mutante de IFN -α2 recombinante según la reivindicación 2 o 3, que comprende además opcionalmente un vehículo aceptable farmacéuticamente.

7. El polipéptido según la reivindicación 2 o 3 para uso como agente terapéutico.

8. Utilización del polipéptido según la reivindicación 2 o 3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención del cáncer, en el que dicho cáncer se selecciona a partir del grupo formado por leucemia de células pilosas, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, leucemia mielógena crónica, linfoma de no Hodgkins y melanoma.

9. El polipéptido según la reivindicación 2 o 3 o la composición farmacéutica según la reivindicación 6 para la utilización en el tratamiento o la prevención del cáncer, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo formado por leucemia de células pilosas, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, leucemia mielógena crónica, linfoma de no Hodgkins y melanoma.

10. Utilización del polipéptido según la reivindicación 2 o 3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la esclerosis múltiple (EM) .

11. El polipéptido según la reivindicación 2 o 3 o la composición farmacéutica según la reivindicación 6 para la utilización para el tratamiento o la prevención de la esclerosis múltiple (EM) .

12. La utilización según la reivindicación 10, el polipéptido para la utilización en el tratamiento o la prevención de la esclerosis múltiple (EM) según la reivindicación 11 o la composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento o la prevención de la esclerosis múltiple (EM) según la reivindicación 11, en el que dicha EM se selecciona del grupo formado por la EM remitente-recividante, EM progresiva secundaria, EM progresiva primaria y EM progresiva de recaída.

13. Utilización del polipéptido según la reivindicación 2 o 3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la infección por virus de la hepatitis.

14. El polipéptido según la reivindicación 2 o 3 o la composición farmacéutica según la reivindicación 6 para la utilización en el tratamiento o la prevención de la infección por virus de la hepatitis.

15. La utilización según la reivindicación 13, el polipéptido para la utilización en el tratamiento o la prevención de la infección por virus de la hepatitis según la reivindicación 14 o la composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento o la prevención de la infección por virus de la hepatitis según la reivindicación 14 en el que dicho virus de la hepatitis se selecciona del grupo formado por la hepatitis A, la hepatitis B y la hepatitis C.