Modulación de la expresión del receptor del factor de crecimiento I similar a la insulina.

Oligonucleótido antisentido que comprende de 8 a 80 nucleobases de longitud,

comprendiendo dichooligonucleótido un tramo de al menos 8 nucleobases consecutivas que es complementario al menos en un 90% a laSEQ ID NO: 160 y que se dirige a una molécula de ácido nucleico que codifica para un receptor de factor decrecimiento similar a la insulina humano (SEQ ID NO: 97), hibridándose específicamente dicho oligonucleótido condicha molécula de ácido nucleico e inhibiendo la expresión de IGF-IR.

Modulación de la expresión del receptor del factor de crecimiento I similar a la insulina

Campo de la invención La presente descripción da a conocer composiciones y métodos para modular la expresión de un gen de receptor de factor de crecimiento. En particular, la invención se refiere a oligonucleótidos que se hibridan con moléculas de ácido nucleico que codifican para el receptor del factor de crecimiento I similar a la insulina (receptor de IGF-I o IGF-IR) . Se muestra a modo de ejemplo en el presente documento que tales oligonucleótidos modulan la proliferación, lo que es relevante para el tratamiento de cáncer y trastornos de la piel proliferativos e inflamatorios. Sin embargo, se entenderá que los oligonucleótidos pueden usarse para cualquier otro estado en el que esté implicado el IGF-IR incluyendo estados inflamatorios.

Antecedentes de la invención Se recogen al final de la descripción detalles bibliográficos de las publicaciones a las que se hace referencia por autor en esta memoria descriptiva.

La referencia a cualquier técnica anterior en esta memoria descriptiva no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en cualquier país.

La psoriasis y otros estados similares son trastornos de la piel proliferativos y/o inflamatorios comunes y a menudo alarmantes que afectan o que tienen el potencial de afectar a una proporción significativa de la población. El estado surge a partir de la sobreproliferación de queratinocitos basales en la capa epidérmica de la piel asociada con inflamación en la dermis subyacente. Aunque se ha desarrollado una gama de tratamientos, ninguno es completamente eficaz ni está libre de efectos secundarios adversos. Aunque la causa subyacente de la psoriasis sigue siendo esquiva, existe algo de consenso de opinión en que el estado surge, al menos en parte, a partir de la sobreexpresión de factores de crecimiento locales y su interacción con sus receptores que favorecen la proliferación de queratinocitos mediante receptores de queratinocitos que parecen ser más abundantes durante la psoriasis.

Un grupo importante de factores de crecimiento son los factores de crecimiento similares a la insulina derivados de la piel (IGF) que favorecen la proliferación de queratinocitos. En particular, IGF-1 y IGF-2 son polipéptidos ubicuos cada uno con potentes efectos mitogénicos sobre una amplia gama de células. Las moléculas del tipo de IGF también se conocen como “factores de progresión” que promueven células “competentes” a través de síntesis de ADN. Los IGF actúan a través de un receptor común conocido como receptor de tipo I o IGF-IR, que está unido a tirosina cinasa. Se sintetizan en tejidos mesenquimatosos, incluyendo la dermis, y actúan sobre células adyacentes de origen mesodérmico, endodérmico o ectodérmico. La regulación de su síntesis implica hormona de crecimiento (GH) en el hígado, pero está mal definida en la mayoría de los tejidos (Sara, Physiological Reviews 70: 591-614, 1990) .

Proteínas particulares, denominadas proteínas de unión a IGF (IGFBP) , parecen estar implicadas en la regulación autocrina/paracrina de la disponibilidad de IGF tisular (Rechler y Brown, Growth Regulation 2: 55-68, 1992) . Hasta la 45 fecha se han identificado seis IGFBP. Los efectos exactos de las IGFBP no están claros y los efectos observados in vitro han sido inhibidores o estimuladores dependiendo del método experimental empleado (Clemmons, Growth Regn. 2:80, 1992) . Sin embargo, hay algunas pruebas de que determinadas IGFBP están implicadas en el direccionamiento de IGF-I a su receptor de la superficie celular.

La piel, que comprende la epidermis y la dermis subyacente, tiene receptores de GH en fibroblastos dérmicos (Oakes et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 73: 1368-1373, 1992) . Los fibroblastos sintetizan IGF-1 así como IGFBP-3, 4, 5 y 6 (Camacho-Hubner et al., J. Biol. Chem. 267: 11949-11956, 1992) que pueden estar implicadas en el direccionamiento de IGF-1 a células adyacentes así como a la epidermis superpuesta. El tipo de célula epidérmica mayoritario, el queratinocito, no sintetiza IGF-I, pero posee receptores de IGF-I y es sensible a IGF-I (Neely et al., J.

Inv. Derm. 96: 104, 1991) .

En la última década, ha habido muchos informes del uso de oligonucleótidos antisentido para explorar la función génica y en el desarrollo de fármacos basados en ácido nucleico. Los oligonucleótidos antisentido inhiben la traducción del ARNm mediante varios modos alternativos que incluyen la destrucción del ARNm diana a través del reclutamiento de ARNasa H, o interferencia con el procesamiento del ARN, la exportación nuclear, el plegamiento o la exploración ribosómica. Más recientemente, un mejor entendimiento de los sitios de acción intracelulares de las diversas modalidades antisentido y mejoras en la química de oligonucleótidos han aumentado el número de informes de inhibición de la expresión validada.

En el trabajo que condujo a la presente invención, los inventores se centraron en el uso del enfoque antisentido para inhibir el crecimiento de queratinocitos epidérmicos humanos, particularmente en trastornos de crecimiento epidérmicos humanos tales como psoriasis. La psoriasis es un estado de la piel común y desfigurante asociado a hiperplasia epidérmica grave. Las terapias existentes para la psoriasis son sólo parcialmente eficaces, sin embargo, tratamientos dirigidos a la epidermis han demostrado ser prometedores (Jensen et al., Br. J. Dermatol. 139: 984-991, 1998; van de Kerkhof, Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 11: 2-10, 1998) . Una estrategia es desarrollar inhibidores antisentido de la expresión de IGF-IR y usarlos para bloquear la supervivencia y división celular estimulada por IGF-I en la epidermis.

El IGF-IR es un receptor de la superficie celular unido a tirosina cinasa (Ullrich et al., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986) que regula la división, transformación y apoptosis celulares en muchos tipos de células (LeRoith et al., Endocr. Rev. 10 16: 143-163, 1995; Rubin y Baserga, Laborator y Investigation 73: 311-331, 1995) . Los queratinocitos epidérmicos humanos son altamente sensibles a la activación de IGF-IR (Ristow y Messmer, J. Cell Physiol. 137: 277-284, 1988; Neely et al., J. Invest. Dermatol. 96: 104-110, 1991; Wraight et al., J. Invest. Dermatol. 103: 627-631, 1994) y varios estudios apuntan a un importante papel de la activación de IGF-1R en la patogénesis de la psoriasis (Krane et al., J. Invest. Dermatol. 96: 419-424, 1991; Krane et al., J. Exp. Med. 175: 1081-1090, 1992; Ristow, Growth Regul. 3: 12915 137, 1993; Hodak et al., J. Invest. Dermatol. 106: 564-570, 1996; Xu et al., J. Invest. Dermatol. 106: 109-112, 1996; Ristow, Dermatology 195: 213-219, 1997; Wraight et al., J. Invest. Dermatol. 108: 452-456, 1997) . El IGF-IR se ha seleccionado como diana previamente por enfoques antisentido en fibroblastos, células hematopoyéticas y células de glioblastoma para investigar su papel en la transformación y la progresión del ciclo celular (Pietrzkowski et al., Mol. Cell Biol. 12: 3883-3889, 1992; Porcu et al., Mol. Cell Biol. 12: 5069-5077, 1992; Reiss et al., Oncogene 7:

2243-2248, 1992; Resnicoff et al., Cancer Res. 54: 2218-2222, 1994) .

Se ha notificado la identificación de oligonucleótidos de fosforotioato propinilados que pueden reducir los niveles de ARNm de IGF-IR cuando se suministran eficazmente al núcleo del queratinocito (White et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10: 195-203, 2000; Wraight et al., Nat. Biotechnol. 18: 521-526, 2000) . Estos oligonucleótidos también eran eficaces en la reducción de la unión a IGF-I, la activación del receptor y la proliferación celular in vitro y la proliferación epidérmica in vivo (Wraight et al., 2000, citado anteriormente) .

Se seleccionaron oligonucleótidos de fosforotioato modificados con propino (Flanagan et al., Nat. Biotechnol. 14: 1139-1145, 1996b; Flanagan y Wagner, Mol. Cell Biochem. 172: 213-225, 1997) porque su afinidad aumentada por el

ARNm diana permite la inhibición del ARNm con concentraciones inferiores (Wagner et al., 1993, citado anteriormente) y su longitud de oligonucleótido más corta (Flanagan et al., Nucleic Acids Res. 24: 2936-2941, 1996a) que fosforotioatos no modificados, reduciendo teóricamente la incidencia de efectos aptaméricos sobre células diana.

Aunque se ha demostrado éxito con los oligonucleótidos de fosforotioato modificados con propino, es necesario considerar químicas alternativas para reducir la toxicidad, aumentar la estabilidad, aumentar el perfil de especificidad, mejorar la penetración y/o intensificar la potencia y... [Seguir leyendo]

1. Oligonucleótido antisentido que comprende de 8 a 80 nucleobases de longitud, comprendiendo dicho oligonucleótido un tramo de al menos 8 nucleobases consecutivas que es complementario al menos en un 90% a la SEQ ID NO: 160 y que se dirige a una molécula de ácido nucleico que codifica para un receptor de factor de crecimiento similar a la insulina humano (SEQ ID NO: 97) , hibridándose específicamente dicho oligonucleótido con dicha molécula de ácido nucleico e inhibiendo la expresión de IGF-IR.

2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, que comprende de 12 a 50 nucleobases de longitud, comprendiendo dicho oligonucleótido un tramo de al menos 8 nucleobases consecutivas que es complementario en un 100% a la SEQ ID NO: 160.

3. Oligonucleótido según la reivindicación 1, que comprende de 15 a 30 nucleobases de longitud, comprendiendo dicho oligonucleótido un tramo de al menos 8 nucleobases consecutivas que es complementario en un 90% a la SEQ ID NO: 160.

4. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un oligonucleótido de ADN, un oligonucleótido de ARN o un oligonucleótido quimérico.

5. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, hibridándose al menos una porción de dicho oligonucleótido con ARN para formar un dúplex de oligonucleótido-ARN.

6. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene al menos un enlace internucleosídico, resto azúcar o nucleobase modificado.

7. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que tiene al menos un resto 2’-O-metoxietilazúcar.

8. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene al menos un enlace internucleosídico de fosforotioato.

9. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que tiene al menos una 5-metilcitosina.

10. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 9, comprendiendo dicho oligonucleótido un tramo de al menos 8 nucleobases consecutivas que es complementario en un 100% a la SEQ ID NO: 160.

11. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 9, comprendiendo dicho oligonucleótido un tramo de al menos 8 nucleobases consecutivas que es complementario al menos en un 95% a la SEQ ID NO: 160.

12. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 9, que comprende al menos 18 nucleobases que son idénticas al menos en un 90% a la SEQ ID NO: 125.

13. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 9, que comprende al menos 15 nucleobases que son idénticas al menos en un 95% a la SEQ ID NO: 125.

14. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 9, que comprende al menos 12 nucleobases que son idénticas en un 100% a la SEQ ID NO: 125.

15. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 9, que consiste en la SEQ ID NO: 125.

16. Oligonucleótido que consiste en 20 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de nucleobases citada en SEQ ID NO: 125 en la que una región de diez desoxinucleótidos está flanqueada en ambos extremos 5’ y 3’ con cinco nucleótidos de 2’-O- (2-metoxietilo) , siendo cada enlace internucleosídico un fosforotioato y cada citosina una 5-metilcitosina.

17. Composición que comprende el oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o una sal del mismo y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

18. Método de diagnóstico in vitro para identificar un estado patológico que comprende identificar la presencia de IGF-IR en una muestra usando un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y/o una composición según la reivindicación 17.

19. Kit o dispositivo de ensayo que comprende el oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y/o una composición según la reivindicación 17.

20. Uso de un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y/o una composición según la

reivindicación 17 en la fabricación de un medicamento para tratar a un animal que tiene una enfermedad, estado o trastorno asociado a IGF-IR, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión de IGF-IR y en el que el trastorno asociado a IGF-IR es un trastorno de la piel seleccionado de psoriasis, ictiosis, pitiriasis rubra pilaris, seborrea, queloides, queratosis, neoplasias, esclerodermia, verrugas, crecimientos benignos o cánceres de la piel.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que el oligonucleótido inhibe la expresión de IGF-IR.

22. Uso según la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el que el animal o mamífero es un ser humano.

23. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que el oligonucleótido es una molécula de ácido nucleico de fosforotioato.

24. Composición según la reivindicación 17, en la que dicho oligonucleótido puede inhibir o reducir de otra manera la proliferación celular u otro trastorno médico mediado por IGF-IR.

25. Composición según la reivindicación 24, en la que dicho oligonucleótido es una molécula de ácido nucleico de fosforotioato.

26. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o composición según la reivindicación 17 para su uso en el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad, estado o trastorno asociado a IGF-IR, inhibiendo dicho oligonucleótido la expresión de IGF-IR.

27. Oligonucleótido o composición según la reivindicación 26, inhibiendo el oligonucleótido la expresión de IGF-IR.

28. Oligonucleótido o composición según la reivindicación 26 ó 27, en el que el trastorno asociado a IGF-IR es un trastorno de la piel seleccionado de psoriasis, ictiosis, pitiriasis rubra pilaris, seborrea, queloides, queratosis, neoplasias, esclerodermia, verrugas, crecimientos benignos o cánceres de la piel.

29. Oligonucleótido o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, siendo el animal o mamífero un ser humano.

30. Oligonucleótido o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, siendo el oligonucleótido una molécula de ácido nucleico de fosforotioato.