Microorganismo recombinante con capacidad de utilizar sacarosa como fuente de carbono.

Un vector recombinante que contiene un gen (ptsG) que codifica una sacarosa fosfotransferasa y un gen sacCque codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa,

en donde el gen ptsG tiene la SEQ ID NO: 2.

Microorganismo recombinante con capacidad de utilizar sacarosa como fuente de carbono

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa y, más particularmente, a un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa en el cual se introduce un gen que codifica sacarosa fosfotransferasa y/o un gen que codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa, o a un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa en el cual se introduce un gen que codifica βfructofuranosidasa, en donde el gen ptsG tiene la SEQ ID NO. 2 y la sacarosa-6-fosfato hidrolasa es un gen sacC.

TÉCNICA DE ANTECEDENTES

Para el desarrollo sostenible del género humano, se están realizando activamente estudios para el desarrollo de la biotecnología industrial para la producción de compuestos útiles a partir de bio-fuentes renovables, junto con un gran interés en los mismos. La producción de sustancias químicas mediante fermentación microbiana se ha realizado hasta la fecha utilizando glucosa como materia prima principal. Sin embargo, la preparación de productos químicos mediante fermentación microbiana es difícil de comercializar, ya que la glucosa es cara y, por lo tanto, el precio de los compuestos químicos producidos por la fermentación microbiana es mayor que el de compuestos químicos producidos por métodos de síntesis química que utilizan aceite crudo como materia prima principal. Así, con el fin de desarrollar como una alternativa al método que utiliza glucosa cara como fuente de carbono, se están realizando activamente estudios sobre el descubrimiento de una diversidad de fuentes de carbono económicas que puedan ser fácilmente obtenidas a partir de bio-fuentes abundantes. Por ejemplo, estudios sobre la producción de diversos metabolitos primarios utilizando materias primas relativamente económicas tales como hidrolizados lignocelulósicos, glicerol, suero lácteo, líquidos de maceración de maíz o similares han sido realizado por muchos investigadores, incluidos los inventores de esta solicitud (Samuelov et al., Appl. Environ, Microbiol., 65:2260, 1999; Lec et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41, 2001; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee et al., Bioproc. Biosystems Eng., 26:63, 2003) . Sin embargo, de acuerdo con los resultados de los estudios reseñados hasta la fecha, en los casos en los que las materias primas fueron utilizadas como fuentes de carbono en lugar de glucosa, la productividad o el rendimiento productivo de metabolitos deseados era significativamente menor que cuando se utilizaba glucosa como una fuente de carbono. Así, para superar este inconveniente se requieren urgentemente una investigación y un desarrollo.

La sacarosa (comúnmente conocida como azúcar) es un disacárido que consiste en glucosa y fructosa, y es una fuente de carbono que es muy abundante en la naturaleza y se produce a partir de todas las plantas con capacidad de fotosíntesis. En particular, la caña de azúcar y la remolacha azucarera contienen grandes cantidades de sacarosa, y más del 60% de la sacarosa del mundo está siendo actualmente producida a partir de la caña de azúcar. Particularmente, la sacarosa se produce a un coste muy bajo, ya que se puede producir industrialmente a través de un simple proceso de evaporar/concentrar extractos obtenidos mediante prensado mecánico de cañas de azúcar. Koutinas et al. calcularon los precios de diversas materias primas utilizables para la producción microbiana de sustancias químicas sobre la base de los contenidos en glucosa en el año 2004 y, como resultado, el precio de sacarosa, basado en 1 kg del contenido en glucosa, era de 26, 1 centavos (0, 19 céntimos de ?) que es un precio muy bajo, correspondiente al 77% del precio del trigo, al 50% del precio de la melaza y al 28, 9% del precio de sacarosa (Koutinas et al., Ind. Crops and Products, 20:75, 2004) .

Un informe sobre el precio diario del International Sugar Agreement (ISA) indica que el precio de la sacarosa se encuentra en una tendencia descendente estable después de alcanzar un pico en 1994-1995 debido a una excedencia de suministro, y que se espera que continúe la tendencia descendente. Por consiguiente, la sacarosa está recibiendo atención como la más potente fuente de carbono que sustituirá a la costosa glucosa que está siendo actualmente utilizada para producir diversos compuestos químicos a través de fermentación microbiana. Particularmente, es bien conocido para los expertos en la técnica que es muy difícil reducir el coste de producción de glucosa al nivel de la sacarosa, ya que la glucosa, la cual se produce principalmente a partir de almidón de maíz, se produce a través de procesos muy complicados que incluyen la extracción de almidón a partir de maíz, tratamiento previo térmico/químico de maíz, conversión de maíz en glucosa mediante reacciones enzimáticas y purificación de glucosa, y debido a que el precio del maíz está en continuo ascenso. Por estos motivos, la producción de bioetanol basada en maíz en los EE.UU. está disminuyendo gradualmente (Mae-Wan Ho, Science in Society, 33:40, 2007) , pero la producción de bioetanol basada en la caña de azúcar (es decir, sacarosa) en Brasil

está creciendo rápidamente.

Hasta la fecha, se han realizado estudios sobre la producción de compuestos útiles utilizando sacarosa como una fuente de carbono con respecto a la producción de polímeros biodegradables (Lee et al., Biotechnol. Lett., 15:971, 1993; Lee et al., Biotechnol. Techniques, 1:59, 1997) , ácido cítrico (Forster et al., App. Microbiol. Biotechnol., 75:1409, 2007) , acetona, butanol, etanol e isopropanol (George et al., Appl. Environ. Microbiol., 45:1160, 1983; Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol., 49:639, 1998) , ácido itacónico (Kautola et al., Biotechnol. Lett., 11:313, 1989) , goma xantano (Letisse et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 55:417, 2001) , etc., mediante cultivo celular a alta concentración. Particularmente, el informe (2006) de la Agencia Internacional de la Energía (IEA) Bioenergy Task 40, que analiza la bioenergía internacional y el comercio de biocombustible evaluaron que la producción de bioetanol a partir de caña de azúcar (incluida sacarosa) en Brasil es un modelo excelente de producción de biocombustible no contaminante y sostenible.

La sacarosa, como una materia prima para producir compuestos químicos a través de fermentación microbiana, es económica y puede actuar para proteger la membrana celular del entorno externo que contiene grandes cantidades de metabolitos deseados, produciendo así elevadas concentraciones de metabolitos deseados. Kilimann et al. expusieron microorganismos a un medio que contenía sacarosa y a un medio que no contenía sacarosa a temperaturas letales, y luego examinaron la viabilidad de los mismos y las estructuras secundarias de las proteínas (Biochimica et Biophysica Acta, 1764, 2006) . Los resultados del estudio revelaron que las estructuras secundarias de proteínas en las células de los microorganismos expuestos al medio que contenía sacarosa estaban muy bien conservadas, pero las estructuras de proteínas en las células de los microorganismos expuestos al medio que contenía sacarosa estaban altamente modificadas. Particularmente, la viabilidad de los microorganismos expuestos al medio que contenía sacarosa era significativamente mayor que la de los microorganismos expuestos al medio que no contenía sacarosa. Esto demuestra directamente la función de sacarosa de proteger microorganismos frente a un entorno externo perjudicial.

A pesar de que la sacarosa es una excelente materia prima que tiene las ventajas arriba descritas, incluido un bajo precio y una función de proteger a microorganismos frente a un entorno externo, todavía no ha sido reseñado ningún ejemplo que muestre la producción con éxito de compuestos químicos deseados utilizando sacarosa como fuente de carbono y la aplicación comercial real de los mismos. Esto se debe a que un gran número de microorganismos no tiene un mecanismo completo de transportar sacarosa a las células, degradando la sacarosa transportada y ligando los productos degradados a la glucolisis y, así, no pueden utilizar sacarosa como fuente de carbono. Incluso en el caso de microorganismos con un mecanismo capaz de utilizar sacarosa, éstos no pueden producir de manera eficaz metabolitos deseados, debido a que la tasa de ingestión y degradación de sacarosa como fuente de carbono es muy baja.

Jahreis et al. 2002 describe vectores recombinantes adecuados para uso en microorganismos que portan los genes cscA y cscB de E. coli que codifican, respectivamente, una sacarosa hidrolasa y una sacarosa permeasa. El documento WO2007/041269 describe también... [Seguir leyendo]

1. Un vector recombinante que contiene un gen (ptsG) que codifica una sacarosa fosfotransferasa y un gen sacC que codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa, en donde el gen ptsG tiene la SEQ ID NO: 2. .

2. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen sacC tiene la SEQ ID NO: 4.

3. Un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa, en que el vector recombinante de la reivindicación 1 se introduce en una célula hospedante seleccionada del grupo que consiste en bacterias,

levaduras y hongos.

4. Un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa, en el que un gen (ptsG) que codifica una sacarosa fosfotransferasa y un gen (sacC) que codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa se introducen en un ADN cromosómico de una célula hospedante seleccionada del grupo que consiste en bacterias, levaduras y hongos, en donde el gen ptsG tiene la SEQ ID NO: 2.

5. El microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el gen sacC tiene la SEQ ID NO: 4.

6. Un método para producir metabolitos, polímeros biodegradables o proteínas recombinantes, comprendiendo el método cultivar el microorganismo recombinante de la reivindicación 3 en un medio que contiene sacarosa como una fuente de carbono.

7. Un método para producir metabolitos, polímeros biodegradables o proteínas recombinantes, comprendiendo el

método cultivar el microorganismo recombinante de la reivindicación 4 en un medio que contiene sacarosa como una fuente de carbono.