Microorganismo modificado por ingeniería genética novedoso que produce ácido homosuccínico y método para preparar ácido succínico usando el mismo.

Mutante bacteriano que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA ) ,

un yen de fosfotransacetilasa (p ta) y un yen de acetato cinasa (a ckA) at mismo tiempo que comprende un yen de piruvato formiato-liasa mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir sólo acido succinico a una alta concentración al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias, en el que el mutante bacteriano se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia , el genero A ctinoba cillus y el genero A na erobiospirillum.

Microorganismo modificado por ingenieria genetica novedoso que produce acid° homosuccinico y metodo para preparar acid° succinico usando el mismo

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un mutante bacteriano del rumen que produce acid° homosuccinico y a un metodo para preparar acid° homosuccinico usando el mismo, y mas particularmente a un mutante bacteriano del rumen que produce acid° succinico a alta concentración at mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias, que se obtiene alterando un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) , un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) , sin

alterar un gen que codifica para piruvato formiato liasa (pt1) , asi como a un metodo para preparar acidos succinicos usando el mismo.

T6cnica anterior

El acid° succinico (HOOCCH2CH2COOH) , un acid° dicarboxilico que consiste en 4 carbonos, es un acid° organic° que tiene muchas utilidades, que se usa ampliamente como precursor de medicamentos, alimentos, cosmeticos y

productos quimicos de otras industrias (Zeikus etal. , Appl. Microbiol. Biotechnol, 51:545, 1999; Song etal., Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006) . Particularmente, se espera que aumente drasticamente la demanda de acid° succinico como fuente principal de macromolecules biodegradables, con el Ultimo aumento brusco de los precios del petradeo (VVillke et al. , Appl. Microbiol. Biotechnol, 66:131, 2004) .

Puede producirse acido succinico mediante sintesis quinnica y fernnentacion. Sin embargo, la mayor parte del acid°

succinico para uso industrial se produce actualmente a traves de metodos de sintesis quimica usando n-butano y acetileno derivados del petroleo como material de particle por companies quimicas chinas, companies quimicas japonesas y grandes companies quimicas tales como BASF, DuPont, BP chemical etc., pero solo una pequena cantidad de acid° succinico para uso especial tal como medicamentos, etc. se produce mediante el metodo de fermentación microbiana tradicional. Los metodos de sintesis quimica mencionados anteriormente tienen el problema de liberar grandes cantidades de desechos peligrosos, efluentes y gas de desecho (por ejemplo, CO, etc.) generados durante el proceso de producciOn de acid° succinico. Particularmente, se usan como material basic° combustibles fOsiles que tiene una alta posibilidad de agotarse y por tanto hay una necesidad urgente de desarrollar un metodo para preparar acidos succinicos reemplazando los combustibles fOsiles por combustibles alternativos tales como recursos renovables.

Para superar estos problemas provocados por el proceso de sintesis quimica para preparar acid° succinico, muchos investigadores han realizado de manera intensive y amplia estudios sobre la producción de acidos succinicos mediante fermentacion microbiana usando diversos recursos renovables. Los microorganismos que se han usado en la producción de acid° succinico varian, pero pueden clasificarse generalmente en Escherichia coli recombinante y bacterias del rumen (Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia, Succinimonas, Succinivibrio, etc.)

(Song etal. , Enzyme Microbial Technol, 39:352, 2006) .

Entre los estudios sobre la produccion de acidos succinicos usando E. coli recombinante, hubo un intento de aumentar la producción de acid° succinico preparando un mutante AFP111 (n.° de la ATCC 202021) obtenido a traves de un metodo en el que se manipula el gen de transporte de glucose (ptsG) mientras que se eliminan los genes (Idhypfl) que estan implicados en la produccion de acid° lactic° y acid° fOrmico en E. coli, por el equipo de

investigaciOn de la Universidad de Chicago (patente estadounidense n.° 5.770.435) .

Los presentes inventores han amplificado un gen de enzima malice (sfcA) implicado en la produccion de acid° succinico, en E. coli recombinante, cepa NZN111, de la que se eliminan los genes Idh y pfl, para suprimir el acid° pirOvico acumulado en el proceso de fermentaciOn de la cepa NZN111, aumentando asi la produccion de acid° succinico (Hong et al. , Biotechnol. Bioeng., 74:89, 2001) . Tambien, un equipo de investigadores dirigidos por la Universidad de Georgia ha construido una cepa AFP111/pTrc99A-pyc que expresa un gen de piruvato carboxilasa (pyc) en la cepa AFP111, y entonces usaron esta cepa en la producciOn de acid° succinico (Vemuri etal., J. Ind. MicrobioL Biotechnol, 28:325, 2001) . Recientemente, para inducir la producciOn de acido succinico en condiciones anaerobias, un equipo de investigadores dirigidos por la Universidad de Rice notificaron que habian construido

cepas de E. coli recombinante manipulando genes implicados en rutas de glicolisis, ciclo de TCA y glioxilato (Lin et a/., Eng., 7:1 16, 2005; Lin etal., Biotechnol. Bioeng., 90:775, 2005) .

Una cepa de Actinobacillus, una cepa de Anaerobiospirillum y una cepa de Mannheimia, que son una clase de bacterias del rumen, se sabe que son excelentes en la produccion de acid° succinico, de modo que se han realizado activamente estudios sobre las cepas. Un equipo de investigadores dirigidos por el Institut° Biotecnologico de

Michigan (MBI) en America descubriO Actinobacillus succinogenes cepa 130Z (n.° de la ATCC 55618) para desarrollar un metodo para producir acid° succinico, y construy6 diversas cepas mutantes de Actinobaci us usando mutagenesis quimica tradicional para su uso en el desarrollo de un procedimiento para

succinogenes, producir y purificar acid° succinico (patents estadounidense n.° 5.521.075; patente estadounidense n.° 5.168.055; patente estadounidense n.° 5.143.834) .

Sin embargo, el procedimiento de produccion de acid° succinico usando fermentaciOn microbiana, desarrollado hasta ahora, tiene una productividad muy baja de menos de 2 g/l/h, y especialmente incurre en un gran coste para separar y purificar el acido succinico porque se produce acid° succinico junto con grandes cantidades de diversos acidos organicos y etanol como subproductos en algun grado durante la fermentación. Aunque los resultados

mencionados anteriormente mostraron un efecto de disminucion de acid° lactic°, acid° formic°, acid° acetic° y etanol como subproductos en algunas cepas recombinantes, no mostraron una eliminacion complete de los mismos. Ademas, en otras cepas mutantes recombinantes, habia algunos casos en los que las tasas de crecimiento de las mismas se han vuelto tan bajas que la productividad de acid° succinico global no aument6. Por tanto, hay una demanda urgente de desarrollar una cepa productora de acid° succinico novedosa, que tenga una alta productividad

deacid° succinico y evite la producción de subproductos (Hong etal., Biotechnol. Lett., 22:871, 2000) .

Para desarrollar una cepa productora de acid° succinico novedosa para satisfacer las demandas anteriores, debe tener prioridad el aislamiento de una cepa que tenga una excelente productividad de acid° succinico, la complecion de la secuencia genomica de la misma, la comprension de las caracteristicas metabOlicas de la misma y el establecimiento de una tecnica de manipulacion genetica requerida para la construccion de una cepa recombinante. 15 Hasta ahora, en el caso de bacterias del rumen que tienen alta productividad de acid° succinico, se complete) la secuencia genOmica complete de la cepa M. succiniciproducens MBEL 55E, pero las de bacterias del rumen tales como Actinobacillus, Anaerobiospirillum etc. a& no se han notificado. Aunque se ha notificado un intento de tratar

de producir acidos succinicos amplificando el gen de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (pckA) de A.succinogenesyA. succiniciproducens en E. coil (Kim et al. , Appl. Environ. Microbiol., 70:1238, 2004; Laivenieks et al. , Appl. Environ. Microbiol., 63:2273, 1997) , no se ha intentado tratar de desarrollar una cepa de produce& de acid° succinico recombinante basandose en la secuencia genomica.

Los presentes inventores han notificado que aislaron M. succiniciproducens MBEL 55E (KCTC0769BP) produciendo acid° succinico con alta eficacia a partir de ganado nativo coreano, y completaron la secuencia genornica y caracterizaron las propiedades metabolicas de la cepa (Hong et al. , Nature Biotechnol, 22: 1275, 2004) . Ademas, los 25 presentes inventores han construido un mutante bacteriano, M. succiniciproducens LPK (KCTC10558BP) alterando un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldha) y un gen que codifica para piruvato formiato-liasa (0) en M. succiniciproducens MBEL 55E que es una clase de bacteria del rumen para inhibir la producción de acidos lacticos y acidos formicos. Ademas de eso, las presentes invenciones han... [Seguir leyendo]

1. Mutante bacteriano que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA) , un yen de fosfotransacetilasa (pta) y un yen de acetato cinasa (ackA) at mismo tiempo que comprende un yen de piruvato formiato-liasa mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir sOlo acid° succinico a una alta concentraciOn al

mismotiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias, en el que el mutante bacteriano se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia, el genero Actinobacillus y el genero Anaerobiospirillum.

2. Mutante bacteriano segun la reivindicacion 1, en el que el mutante bacteriano es una cepa de fermentación

homogenea que produce solo acid° succinico al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos como subproductos.

3. Mutante bacteriano segOn la reivindicaciOn 1, en el que la cantidad de cada uno de los otros acidos organicos producidos como subproductos es inferior al 1% en peso basandose en la cantidad de acid° succinico producido.

4. Mutante bacteriano segOn la reivindicacion 1, en el que los otros acidos organicos son uno cualquiera o

masacidos organicos seleccionados del grupo que consiste en acid° lactic°, acid° acetic°, acid° fórmico y acid° pirOvico.

5. Mutante bacteriano Mannheimia succinicipnoducens PALK (KCTC10973BP) , que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA) , un yen de fosfotransacetilasa (pta) y un yen de acetato cinasa (ackA) , al mismo tiempo que comprende un gen de piruvato formiato-liasa (ptT) , mutante bacteriano que tiene la

propiedad de producir acid° succinico a una alta concentracion al mismo tiempo que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.

6. Metodo para producir el mutante bacteriano segun la reivindicaciOn 1, comprendiendo el metodo las etapas de:

(a) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA)

alterandoel gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) en el genoma de una bacteria que se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia, el *len) Actinobacillus y el genero Anaerobiospitillum, usando recombinación hornologa; y

(b) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) , un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un yen que codifica para acetato cinasa (ackA)

alterandoel yen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y el yen que codifica para acetato cinasa (ackA) en

el genoma del mutante bacteriano que carece de un yen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) usando recombinación homOloga.

7. Metodo para producir el mutante bacteriano segOn la reivindicacion 6, en el que la recombinación hornologa de la etapa (a) se realiza usando un vector de intercambio genetic° que contiene un IdhA alterado.

8. Metodo para producir el mutante bacteriano segOn la reivindicacion 6, en el que la recombinación homologa de la etapa (b) se realiza usando un vector de intercambio genetic° que contiene un pta-ackA alterado.

9. Metodo para producir el mutante bacteriano segOn la reivindicaciOn 7, en el que el vector de intercambio genetic° que contiene un IdhA alterado es pMLKO-sacB.

10. Metodo para producir el mutante bacteriano segun la reivindicaciOn 8, en el que el vector de intercambio genetic° que contiene un pta-ackA alterado es pMPKO-sacB.

11. Metodo para producir acid° succinico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante

bacteriano segOn una reivindicacion cualquiera entre las reivindicaciones 1 a 4 en condiciones anaerobias; y recuperar acid° succinico del caldo de cultivo.

como fuentede carbono para el cultivo.

12. Metodo para producir acid° succinico segOn la reivindicacion 11, en el que se usa glucosa o glicerol

13. Metodo para preparar acid° succinico segOn la reivindicaciOn 11, en el que la cantidad de cada uno de los otros acidos organicos producidos como subproductos es inferior al 1% en peso basandose en la cantidad de acid° succlnico producido.

14. Metodo para preparar acid° succinico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante

bacteriano Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) en condiciones anaerobias; y recuperar acid° succinico del caldo de cultivo.

como

15. Metodo para preparar acid° succinico segOn la reivindicacion 14, en el que se usa glucosa o glicerol

fuente de carbono para el cultivo.

16. Metodo para preparar acid° succinico segun la reivindicacion 14, en el que la cantidad de cada uno de los otros acidos organicos producidos como subproductos es inferior al 1% en peso basandose en la cantidad de acido succinico producido.

'ilacosa FIG. 1

Glue ( a-) -P 1. 13 iOflRL,

Fostecnolpiruvato Acido lactic°

AA

Oxal Piruvato oactBAG Acid () formico. C°2 112 ONE

alato AcctiiCoA

Furnaralo freifrid: Acido aca A Etanol

cid () succi nic (

FIG. 2

pUC18 (vim Sad Ori (ió 1 hoinOloga a kilh1 ) , pUC1 84.1 (lch)

(region 2 iPsti moioga a /Au) AR

1 Pal Psi! Kindill El S

Cow, crsiiin dc Saden es1 sill.) A.M./ . onelliante SEV ID O. 5 X64, 1 coca Alxit

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FIG. 3

pMLKO-sacE3

17'.111tb)

RegieIn 2 .1116lop a klit. .1

Regi4n I .homologa a

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Croinosoina tie fannireimio snecinivipro u (ors M1111, 551: (sihesir

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LK

FIG. 4

On BconHI 1, 1, c, ..gion 1 homologa rh l-aciA)

pUC19

(RigOn 2 homillogaa p1ts-thi.4) EcoRV

pUC19-PTAl2

PA2 PA1

pUC19-PTA1S2!

Rcgion I hointiloga a pra.ackA ftc:ii; km 2 hostOloga pia-ack, 4

FIG. 5

pPTA-sacE3

RegiOn 2 ho-mtiloga a pro-ock, l Region. I homologa apla.aciA

Cronin:Anna de Aucciniciproducens LK

Region 2 htmOkg t pli, ck.t ReJi6aI' lunnologa a pra-ack I

enizainiento dnble en medic) de sacarasa"Sp

SeleeciAn resisterne a Sp, .scasible a Ap

'Region 2' hoinologa a 1, 1 (4-irekA SpR (Trornosoina de

Reg ion I' hot nolaga a pia-ockA

YfIceitlicipror

.herens

PALK

OOP

. A C 1) .! • XI

FIG, 7

50 40. 30 Glucosa Gliceral Acid° succirmco Acidolactic° --tt-Acido formico—*-Acido acitico Acido pirtwico

2.0

10

0 0, 00 5.00 10, 00 15, 00 Tiempo 20, 00 • 25, 00