Métodos y sistemas relacionados con nucleótidos terminadores 2''.

Método de extensión de un cebador de ácidos nucleicos, comprendiendo el método:

incubar un ácido nucleicomolde con por lo menos un biocatalizador que incorpora nucleótidos, por lo menos un nucleótido terminador 2' y porlo menos un cebador de ácidos nucleicos que es por lo menos parcialmente complementario a por lo menos unasubsecuencia del ácido nucleico molde, en el que dicho cebador de ácidos nucleicos comprende ADN, bajocondiciones en las que el biocatalizador que incorpora nucleótidos extiende el cebador de ácidos nucleicos paraproducir por lo menos un cebador de ácidos nucleicos extendido mediante la incorporación del nucleótido terminador2' en un extremo terminal del cebador de ácidos nucleicos extendido,

en el que el nucleótido terminador 2' comprende la fórmula:**Fórmula**

Métodos y sistemas relacionados con nucleótidos terminadores 2'.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere de manera general a la química y biología molecular de los ácidos nucleicos. Más concretamente, la invención proporciona métodos de secuenciación y marcaje de ácidos nucleicos, además de otros aspectos relacionados en los que participan nucleótidos terminadores 2'.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La secuenciación de ácidos nucleicos implica la determinación de la secuencia de nucleótidos de una molécula particular de ácidos nucleicos. El conocimiento de la secuencia de una molécula de ácidos nucleicos típicamente resulta fundamental para elucidar la función de la molécula y para facilitar la manipulación de la misma. Además, las variaciones en los genomas individuales con frecuencia explican las diferencias de susceptibilidad a enfermedades y las respuestas farmacológicas al tratamiento. A título ilustrativo, los cambios en una única base de una molécula de ácidos nucleicos, que comúnmente se denominan polimorfismos de nucleótido único (SNP) , pueden afectar al riesgo individual de presentar una enfermedad dada. Mediante la comparación de estas variaciones, por ejemplo, los investigadores están mejorando la comprensión de la utilidad médica de los SNP, incrementando de esta manera nuestra capacidad de diagnosticar, pronosticar y tratar con efectividad las enfermedades.

La tecnología de secuenciación de ácidos nucleicos se inició a finales de los años 60 con intentos para secuenciar el ARN. En particular, la secuencia del ARN ribosómico 5S de Escherichia coli (Brownlee et al., "Nucleotide sequence of 5S-ribosomal RNA from Escherichia coli, " Nature 215 (102) :735, 1967) y el ARN del bacteriófago R17 codificante de proteína de cubierta (Adams et al., "Nucleotide sequence from the coat protein cistron of R17 bacteriophage RNA", Nature 223 (210) :1009, 1969) son algunos de los primeros ejemplos de secuenciación del ARN. Posteriormente, Sanger describió la secuenciación del ADN del bacteriófago f1 mediante síntesis cebada con ADN polimerasa (Sanger et al., "Use of DNA polymerase I primed by a synthetic oligonucleotide to determine a nucleotide sequence in phage f1 DNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 (4) :1209, 1973) , mientras que Gilbert y Maxam informaron de la secuencia de nucleótidos de ADN del operador lac (Gilbert y Maxam, "The nucleotide sequence of the lac operator", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 (12) :3581, 1973) .

En 1977, Sanger describió la utilización de nucleósidos trifosfato modificados (incluyendo dideoxirribosa) en combinación con desoxirribonucleótidos para terminar el alargamiento de cadena (Sanger et al., "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors", Biotechnology 24:104, 1977) . En ese mismo año, Maxam y Gilbert informaron de un método para secuenciar ADN que utilizaba el corte químico del ADN preferentemente en guaninas, en adeninas, en citosinas y timinas igualmente, y únicamente en citosinas (Maxam y Gilbert, "A new method for sequencing DNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560, 1977) . Estos dos métodos aceleraron la secuenciación manual basada en la separación electroforética de fragmentos de ADN marcados con marcadores radioactivos y la posterior detección mediante autorradiografía.

El uso del método dideoxi de Sanger para la secuenciación del ADN se ha extendido mucho más ampliamente que el método de corte químico de Maxam-Gilbert. El método de Sanger incluye la síntesis de una nueva cadena de ADN partiendo de un sitio de cebado específico y finalizando con la incorporación de un nucleótido de terminación de cadena o terminador. En particular, una ADN polimerasa extiende un ácido nucleico cebador hibridado con una localización específica sobre un molde de ADN mediante la incorporación de desoxinucleótidos (dNTP) complementarios al molde. La síntesis de la nueva cadena de ADN continúa hasta que se termina aleatoriamente la reacción mediante la inclusión de un dideoxinucleótido (ddNTP) . Estos análogos de nucleótido son incapaces de proporcionar soporte a la extensión posterior de la cadena debido a que la fracción ribosa de ddNTP no presenta el 3'-hidroxilo necesario para formar un enlace fosfodiéster con el dNTP siguiente. Esto produce una población de fragmentos de secuenciación truncados, cada uno con un extremo 5' definido o fijado y un extremo 3' variable. Entre las desventajas del método dideoxi se encuentra el coste asociado a la preparación de los ddNTP.

Dos metodologías de secuenciación automática utilizados frecuentemente son la secuenciación de pigmento-ácido nucleico cebador y de pigmento-terminador. Estos métodos resultan adecuados para la utilización con fracciones de marcaje fluorescente. Aunque la secuenciación también puede llevarse a cabo utilizando fracciones de marcaje radioactivo, la secuenciación basada en la fluorescencia resulta crecientemente preferente. Brevemente, en la secuenciación de pigmento-cebador, se utiliza un cebador marcado fluorescentemente en combinación con ddNTP no marcados. El procedimiento típicamente utiliza cuatro reacciónes de síntesis y hasta cuatro carriles en un gel para cada molde que debe secuenciarse (uno correspondiente a cada uno de los productos de terminación específicos de base) . Tras la extensión del ácido nucleico cebador, las mezclas de reacción de secuenciación que contienen productos de terminación dideoxinucleótido incorporados se someten rutinariamente a electroforesis en un gel de secuenciación de ADN. Tras la separación mediante electroforesis, los productos marcados fluorescentemente se excitan en el gen con un láser y se detecta la fluorescencia con un detector apropiado. En sistemas automáticos, un detector escanea el fondo del gel durante la electroforesis con el fin de detectar la fracción de marcaje que se ha utilizado, a medida que las reacciónes recorren la matriz de gel (Smith et al., "Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis", Nature 321:674, 1986) . En una modificación de este método, se marca cada uno de los cuatro cebadores con un marcador fluorescente diferente. Tras completarse las cuatro reacciónes de secuenciación diferentes, las mezclas se combinan y la reacción se somete a análisis en gel en un solo carril, y se detectan individualmente las diferentes etiquetas fluorescentes (una para cada uno de los cuatro diferentes productos de terminación específicos de base) .

Alternativamente se utilizan métodos de secuenciación de pigmento-terminador. En este método, se utiliza una ADN polimerasa para incorporar los dNTP y ddNTP marcados fluorescentemente en el extremo en crecimiento de un cebador de ADN (Lee et al., "DNA sequencing with dye-labeled terminators and T7 DNA polymerase: effect of dyes and dNTPs on incorporation of dye terminators and probability analysis of termination fragments", Nucleic Acid Res. 20:2471, 1992) . Este procedimiento ofrece la ventaja de que no resulta necesario sintetizar cebadores marcados con pigmento. Además, las reacciónes de pigmento-terminador resultan más convenientes en el aspecto de que la totalidad de las cuatro reacciónes puede llevarse a cabo en el mismo tubo.

Entre otros métodos de deconvolución de mezclas de reacción de secuenciación se incluyen la utilización de espectrometría de iones en fase gaseosa. Por ejemplo, la espectrometría de masas de tiempo de vuelo y desorción/ionización por láser asistida por matriz (EM MALDI-TOF) es un enfoque que se ha utilizado con éxito en la secuenciación de alto rendimiento y análisis de genotipado de SNP (ver, por ejemplo, Sauer et al., "Facile method for automated genotyping of single nucleotide polymorphisms by mass spectrometr y ", Nucleic Acids Res. 30 (5) :e22, 2002) .

A partir de lo anteriormente expuesto, resulta evidente que resultan deseables métodos de secuenciación y genotipado adicionales de los ácidos nucleicos. La presente invención proporciona nuevos métodos de secuenciación de ácidos nucleicos que utilizan nucleótidos terminadores 2', así como una diversidad de características adicionales, incluyendo enfoques al marcaje de ácidos nucleicos que resultarán evidentes a partir de una revisión completa de la exposición siguiente.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos de secuenciación y marcaje de ácidos nucleicos que utilizan ácidos nucleicos terminadores 2', por ejemplo en lugar de ddNTP, aciclonucleótidos trifosfato u otros tipos de terminadores de extensión de ácidos nucleicos. Entre los nucleótidos terminadores 2' de la invención, que presentan anillos de azúcar intactos (por ejemplo anillos de azúcar pentosa) o anillos análogos de azúcar (por ejemplo anillos carbocíclicos,... [Seguir leyendo]

1. Método de extensión de un cebador de ácidos nucleicos, comprendiendo el método: incubar un ácido nucleico molde con por lo menos un biocatalizador que incorpora nucleótidos, por lo menos un nucleótido terminador 2' y por lo menos un cebador de ácidos nucleicos que es por lo menos parcialmente complementario a por lo menos una subsecuencia del ácido nucleico molde, en el que dicho cebador de ácidos nucleicos comprende ADN, bajo condiciones en las que el biocatalizador que incorpora nucleótidos extiende el cebador de ácidos nucleicos para producir por lo menos un cebador de ácidos nucleicos extendido mediante la incorporación del nucleótido terminador 2' en un extremo terminal del cebador de ácidos nucleicos extendido, en el que el nucleótido terminador 2' comprende la fórmula:

en la que: R1 es OH, B es por lo menos un anillo homocíclico, por lo menos un anillo heterocíclico, por lo menos un grupo arilo, o combinaciones de los mismos, BG es un grupo bloqueante, y Z es 0 o CH2, y ---- representa un enlace sencillo o doble, en el que BG comprende la fórmula:

en la queX es O, S, NR3, CR3R4, o SiR3R4; Y es CR5R6R7, SiR5R6R7, OR5, SR5, o NHR5; R2 es H, OH, NHR8, SR8, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquenilo o combinaciones de los mismos, o

en la que: X es CR3R4R5, SiR3R4R5, OR3, SR3, o NHR3; R2 es H, OH, NHR6, SR6, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, o combinaciones de los mismos.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el nucleótido terminador 2' comprende un nucleósid.

2. monofosfato3'-hidroxil-5'-trifosfato o un grupo bloqueante cargado negativamente.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el biocatalizador que incorpora nucleótidos comprende un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste de: una polimerasa, una transferasa terminal, una transcriptasa inversa, una polinucleótido fosforilasa y una telomerasa.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el enzima comprende una mutación que incrementa la incorporación de ribonucleótidos.

5. Método según la reivindicación 3, en el que el enzima comprende una mutación que reduce o elimina la actividad de exonucleasa 5' a 3'.

6. Método según la reivindicación 3, en el que el enzima comprende una mutación que incrementa la incorporación de análogo.

2. modificados de ribonucleótidos.

7. Método según la reivindicación 1, que comprende además la detección de la totalidad o de una parte del cebador

de ácidos nucleicos extendido o de un fragmento del mismo.

8. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos uno de entre el nucleótido terminador 2', el cebador de ácidos nucleicos extendido y el cebador de ácidos nucleicos comprende por lo menos un marcaje.

9. Método según la reivindicación 8, en el que se une un marcaje a uno de entre una base heterocíclica del nucleótido terminador 2', una fracción sacárida del nucleótido terminador 2' y un grupo fosfato del nucleótido terminador 2'.

10. Método según la reivindicación 8, en el que un conector une un marcaje al nucleótido terminador 2'.

11. Método según la reivindicación 8, que comprende además la detección de una señal detectable producida por el marcaje.

12. Método según la reivindicación 8, en el que el marcaje comprende un pigmento fluorescente, un marcaje débilmente fluorescente, un marcaje no fluorescente, un marcaje colorimétrico, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje bioluminiscente, un isótopo radioactivo, un anticuerpo, un antígeno, biotina, un hapteno o un enzima.

13. Método según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico de molde o el cebador de ácidos nucleicos se une a un soporte sólido.

14. Método según la reivindicación 1, que comprende además incubar el ácido nucleico de molde con por lo menos un nucleótido extensible.

15. Método según la reivindicación 14, que comprende incubar el ácido nucleico de molde con por lo menos una pirofosfatasa que minimiza la pirofosforolisis.

16. Método según la reivindicación 14, en el que los nucleótidos terminadores 2' y los nucleótidos extensibles se encuentran presentes en una proporción molar de 1:1 ó inferior.

17. Método según la reivindicación 14, en el que el biocatalizador que incorpora nucleótidos produce múltiples cebadores de ácidos nucleicos extendidos diferentes y el método comprende la resolución de múltiples cebadores de ácidos nucleicos extendidos diferentes, de manera que por lo menos una parte de una secuencia de bases del ácido nucleico de molde es determinable a partir del cebador de ácidos nucleicos extendido que se ha resuelto.

18. Método según la reivindicación 17, en el que los cebadores de ácidos nucleicos extendidos se resuelven mediante la determinación de por lo menos una de las masas moleculares, tamaños y/o propiedades de carga de los cebadores de ácidos nucleicos extendidos.

19. Método según la reivindicación 17, en el que los cebadores de ácidos nucleicos extendidos comprenden además marcajes y los cebadores de ácidos nucleicos extendidos se resuelven mediante separación de los cebadores de ácidos nucleicos extendidos marcados unos de otros y la detección de las señales detectables producidas por los marcajes.

20. Método de extensión de un ácido nucleico, comprendiendo el método: incubar por lo menos un ácido nucleico con por lo menos un biocatalizador que incorpora nucleótidos y por lo menos un nucleótido terminador 2', de manera que el biocatalizador que incorpora nucleótidos extiende el ácido nucleico, produciendo por lo menos un ácido nucleico extendido mediante la incorporación del nucleótido terminador 2' marcado en un extremo terminal del ácido nucleico, en el que el nucleótido terminador 2' marcado comprende la fórmula:

en la que: R1 es OH, B es por lo menos un anillo homocíclico, por lo menos un anillo heterocíclico, por lo menos un grupo arilo, o combinaciones de los mismos, BG es un grupo bloqueante, y Z es 0 o CH2, y ---- representa un enlace sencillo o doble, en el que BG comprende la fórmula:

en la que: X es O, S, NR3, CR3R4 ó SiR3R4, Y es CR5R6R7, SiR5R6R7, OR5, SR5 ó NHR5, R2 es H, OH, NHR8, SR8, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, o combinaciones de los mismos, o

en el que: X es CR3R4R5, SiR3R4R5, OR3, SR3 ó NHR3; R2 es H, OH, NHR6, SR6, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi, o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquinilo o combinaciones de los mismos.

21. Método según la reivindicación 20, en el que el biocatalizador que incorpora nucleótidos comprende un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste de: una transferasa terminal y una polinucleótido fosforilasa.

22. Método según la reivindicación 20, en el que el nucleótido terminador 2' marcado comprende un nucleósido 2'monofosfato-3'-hidroxil-5'-trifosfato.

23. Método según la reivindicación 20, que comprende además hibridar el ácido nucleico extendido con otro ácido nucleico y detectar una señal detectable producida por el marcaje.

24. Método según la reivindicación 20, en el que el ácido nucleico comprende un cebador de ácidos nucleicos que es por lo menos parcialmente complementario respecto a por lo menos una subsecuencia de un ácido nucleico de molde, y el método comprende incubar el ácido nucleico de molde con el biocatalizador que incorpora nucleótidos, el nucleótido terminador 2' marcado y el cebador de ácidos nucleicos.

25. Método según la reivindicación 24, en el que el biocatalizador que incorpora nucleótidos comprende un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste de: una polimerasa, una transferasa terminal, una transcriptasa inversa, una polinucleótido fosforilasa y una telomerasa.

26. Método según la reivindicación 24, que comprende además incubar el ácido nucleico de molde con por lo menos un nucleótido extensible.

27. Método según la reivindicación 26, en el que el biocatalizador que incorpora nucleótidos produce múltiples cebadores de ácidos nucleicos extendidos diferentes y el método comprende resolver múltiples cebadores de ácidos nucleicos extendidos diferentes, de manera que por lo menos una parte de una secuencia de bases del ácido nucleico de molde es determinable a partir del cebador de ácidos nucleicos extendido que se ha resuelto.

28. Método según la reivindicación 27, en el que los cebadores de ácidos nucleicos extendidos se resuelven mediante la determinación de por lo menos una de las masas moleculares, tamaños y/o propiedades de carga de los cebadores de ácidos nucleicos extendidos.

29. Método según la reivindicación 27, en el que el cebador de ácidos nucleicos extendidos se resuelven mediante la separación de los cebadores de ácidos nucleicos extendidos unos respecto a otros y la detección de las señales detectables producidas por los marcajes.

30. Método de inhibición de la extensión posterior de un ácido nucleico extendido, comprendiendo el método: poner en contacto por lo menos un ácido nucleico con por lo menos un biocatalizador que incorpora nucléotidos y por lo menos un nucleósido o nucleótido terminador 2' ó una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el ácido nucleico comprende ADN y en el que el nucleósido o nucleótido terminador 2', o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, no es extensible por el biocatalizador que incorpora nucleótidos, de manera que el biocatalizador que incorpora nucleótidos extiende el ácido nucleico, produciendo por lo menos un ácido nucleico extendido mediante la incorporación del nucleósido o nucleótido terminador 2' marcado, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en un extremo terminal del ácido nucleico, inhibiendo de esta manera la extensión posterior del ácido nucleico extendido. en el que el nucleótido terminador 2' comprende la fórmula:

en la que: R1 es OH, B es por lo menos un anillo homocíclico, por lo menos un anillo heterocíclico, por lo menos un grupo arilo, o combinaciones de los mismos, BG es un grupo bloqueante, y Z es 0 o CH2, y ---- representa un enlace sencillo o doble, en el que BG comprende la fórmula:

en la que: X es O, S, NR3, CR3R4 ó SiR3R4; Y es CR5R6R7, SiR5R6R7, OR5, SR5 ó NHR5, R2 es H, OH, NHR8, SR8, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, o combinaciones de los mismos, o

en la que: X es CR3R4R5, SiR3R4R5, OR3, SR3, o NHR3, R2 es H, OH, NHR6, SR6, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi, o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo o combinaciones de los mismos.

31. Método según la reivindicación 30, en el que el ácido nucleico comprende ADN microbiano.

32. Método según la reivindicación 31, en el que el ADN microbiano, el biocatalizador que incorpora nucleótidos y el nucleósido o nucleótido terminador 2', o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se pone en contacto en un huésped infectado por un microbio que comprende el ADN microbiano.

33. Método de secuenciación de un ácido nucleico diana, comprendiendo el método:

(a) incubar por lo menos un ácido nucleico diana con una o más polimerasas, uno o más nucleótidos terminadores 2', uno o más nucleótidos extensibles, y uno o más cebadores de ácidos nucleicos que son complementarios a por lo menos una subsecuencia del ácido nucleico diana, en el que las polimerasas extienden los cebadores de ácidos nucleicos para producir productos de extensión de cebador que incorporan los nucleótidos terminadores 2' en los extremo.

3. terminales de los productos de extensión de cebador, y

(b) identificar los nucleótidos terminadores 2' en los productos de extensión de cebador, de manera que por lo menos una parte de una secuencia de bases del ácido nucleico diana sea determinable a partir de los nucleótidos terminadores 2' identificados.

en el que el nucleótido terminador 2' comprende la fórmula:

en la que: R1 es OH, B es por lo menos un anillo homocíclico, por lo menos un anillo heterocíclico, por lo menos un grupo arilo, o combinaciones de los mismos,

y Z es O ó CH2, y representa un enlace sencillo o doble, en el que BG comprende la fórmula:

en la que: X es O, S, NR3, CR3R4 ó SiR3R4, Y es CR5R6R7, SiR5R6R7, OR5, SR5 ó NHR5, R2 es H, OH, NHR8, SR8, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi, o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo o combinaciones de los mismos, o

en la que: X es CR3R4R5, SiR3R4R5, OR3, SR3 ó NHR3, R2 es H, OH, NHR6, SR6, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi, o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo o combinaciones de los mismos.

34. Método según la reivindicación 33, en el que (a) comprende incubar el ácido nucleico diana, las polimerasas, los nucleótidos extensibles y los cebadores de ácidos nucleicos con por lo menos dos nucleótidos terminadores diferentes.

35. Método según la reivindicación 33, en el que (a) comprende múltiples reacciónes separadas, en las que por lo menos dos de las reacciónes comprenden nucleótidos terminadores 2' diferentes.

36. Método según la reivindicación 34, en el que los nucleótidos terminadores 2' diferentes comprenden marcajes diferentes.

37. Método según la reivindicación 33, en el que (b) comprende determinar las masas moleculares de los productos de extensión de cebador o los fragmento.

3. terminales de los mismos y la secuencia del ácido nucleico diana a partir de las masas moleculares.

38. Método según la reivindicación 33, en el que los productos de extensión de cebador comprenden marcajes y (b) comprenden separar los productos de extensión de cebador unos de otros y detectar las señales detectables producidas por los marcajes.

39. Método según la reivindicación 38, en el que los productos de extensión de cebador se separan mediante una o más técnicas de separación seleccionadas de entre el grupo que consiste de electroforesis, cromatografía y espectrometría de iones en fase gaseosa.

40. Mezcla de reacción que comprende por lo menos un nucleótido terminador 2' marcado y por lo menos un biocatalizador que incorpora nucleótidos, en la que el nucleótido terminador 2' marcado comprende la fórmula:

en la que: R1 es OH, B es por lo menos un anillo homocíclico, por lo menos un anillo heterocíclico, por lo menos un grupo arilo, o combinaciones de los mismos, BG es un grupo bloqueante,

y Z es 0 0 CH2, y representa un enlace sencillo o doble, en el que BG comprende la fórmula:

en la que: X es O, S, NR3, CR3R4, o SiR3R4, Y es CR5R6R7, SiR5R6R7, OR5, SR5, o NHR5, R2 es H, OH, NHR8, SR8, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi, o combinaciones de los mismos, y

R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo o combinaciones de los mismos, o en la que: X es CR3R4R5, SiR3R4R5, OR3, SR3 ó NHR3, R2 es H, OH, NHR6, SR6, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi, o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo o combinaciones de los mismos.

41. Mezcla de reacción según la reivindicación 40, en la que el nucleótido terminador 2' comprende un nucleósid.

2. monofosfato-3'-hidroxilo.

42. Mezcla de reacción según la reivindicación 40, que comprende además por lo menos una pirofosfatasa.

43. Mezcla de reacción según la reivindicación 40, en la que B comprende una fórmula seleccionada de entre el

grupo que consiste de: a)

en la que: X1 y X2 se seleccionan independientemente de entre CH y N,

R2 es H, OH ó NR4R5, R3 es H, OH ó NR6R7, R4 y R5 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi y combinaciones de los mismos, y R6 y R7 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo,

un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi y combinaciones de los mismos, b)

en la que: X1 y X2 se seleccionan independientemente de entre CH y N, R2 es O ó S, R3 es H, OH ó NR4R5, y R4 y R5 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi y combinaciones de los mismos, c)

en la que:R2 es H, OH ó NR4R5, R3 es H, OH ó NR6R7, R4 y R5 se seleccionan independientemente de entre H,

un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi y combinaciones de los mismos, y R6 y R7 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi y combinaciones de los mismos, d)

en la que: X1 y X2 se seleccionan independientemente de entre CH y N, R2 se selecciona de entre H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi, o combinaciones de los mismos, y R3 es O o S. e)

en la que: R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre O y S, y R4 y R5 se seleccionan independientemente de entre H, NH2, SH, OH, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi, un grupo alcoxi, un grupo halo, y combinaciones de los mismos,

en la que: R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre O y S, y R4 es H, NH2, SH, OH, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi, un grupo alcoxi, un grupo halo, o combinaciones de los mismos, en el que R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre O y S,

g)

en la que R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre O y S, h)

en la que R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre O y S, i)

en la que: R2 es O ó S, y R3 y R4 se seleccionan independientemente de entre H, NH2, SH, OH, COOH, COOCH3, COOCH2CH3, CHO,

NO2, CN, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi, un grupo alcoxi, un grupo halo, o combinaciones de los mismos, y R5 es un grupo alquilo, un grupo alcoxi, un grupo alquenilo, un grupo alquenoxi, un grupo alquinilo, un grupo alquinoxi, un grupo arilo, un grupo ariloxi, un grupo bencilo, un grupo benciloxi o combinaciones de los mismos, j)

en la que: X es CH o N, R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre H, OH y NHR4,

R4 es H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi o combinaciones de los mismos, y R5 es OH, NH2, SH, un grupo halo, un grupo éter, un grupo tioéter, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alquilamina, un grupo alquenilamina, un grupo alquinilamina o combinaciones de los mismos, y

k)

en la que: X es CH o N, R2 es O ó S,

R3 es H, OH ó NHR4, R4 es H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi o combinaciones de los mismos, y R5 es OH, NH2, SH, un grupo halo, un grupo éter, un grupo tioéter, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alquilamina, un grupo alquenilamina, un grupo alquinilamina o combinaciones de los mismos.

44. Mezcla de reacción según la reivindicación 40, en la que se une el marcaje a uno de entre una base heterocíclica del nucleótido terminador 2', una fracción sacárida del nucleótido terminador 2' y un grupo fosfato del nucleótido terminador 2'.

45. Mezcla de reacción según la reivindicación 40, en la que un conector une un marcaje al nucleótido terminador 2'.

46. Mezcla de reacción según la reivindicación 40, en la que el marcaje comprende un pigmento fluorescente, un

marcaje débilmente fluorescente, un marcaje no fluorescente, un marcaje colorimétrico, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje bioluminiscente, un isótopo radioactivo, un anticuerpo, un antígeno, biotina, un hapteno o un enzima.

47. Mezcla de reacción según la reivindicación 40, que comprende además por lo menos uno o más nucleótidos extensibles.

48. Mezcla de reacción según la reivindicación 47, en la que se marca por lo menos uno de los nucleótidos extensibles.

49. Mezcla de reacción según la reivindicación 47, en la que el nucleótido terminador 2' y los nucleótidos extensibles se encuentran presentes en una proporción molar de 1:1 ó inferior.

50. Mezcla de reacción según la reivindicación 40, en la que el biocatalizador que incorpora nucleótidos comprende un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste de: una polimerasa, una transferasa terminal, una transcriptasa inversa, una polinucleótido fosforilasa y una telomerasa.

51. Mezcla de reacción según la reivindicación 50, en la que el enzima comprende una mutación que incrementa la incorporación de ribonucleótidos.

52. Mezcla de reacción según la reivindicación 50, en la que el enzima comprende una mutación que reduce o elimina la actividad de exonucleasa 5' a 3'.

53. Mezcla de reacción según la reivindicación 50, en la que el enzima comprende una mutación que incrementa la incorporación de análogo.

2. modificados de ribonucleótidos.

54. Mezcla de reacción según la reivindicación 40, que comprende además un ácido nucleico de molde y un cebador de ácidos nucleicos que es por lo menos parcialmente complementario a por lo menos una subsecuencia del ácido nucleico de molde.

55. Mezcla de reacción según la reivindicación 54, en la que el ácido nucleico de molde o el cebador de ácidos nucleicos se une a un soporte sólido.

56. Mezcla de reacción según la reivindicación 54, en la que el cebador comprende un marcaje.

57. Mezcla de reacción según la reivindicación 56, en la que el marcaje comprende un pigmento fluorescente, un marcaje débilmente fluorescente, un marcaje no fluorescente, un marcaje colorimétrico, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje bioluminiscente, un isótopo radioactivo, un anticuerpo, un antígeno, biotina, un hapteno o un enzima.

58. Kit para extender un ácido nucleico, que comprende:

(a) por lo menos un biocatalizador que incorpora nucleótidos, y

(b) por lo menos un nucleótido terminador 2' marcado,

en el que el nucleótido terminador 2' marcado comprende la fórmula:

en la que: R1 es OH, B es por lo menos un anillo homocíclico, por lo menos un anillo heterocíclico, por lo menos un grupo arilo, o combinaciones de los mismos,

y Z es 0 0 CH2, y representa un enlace sencillo o doble, en el que BG comprende la fórmula:

en la que: X es O, S, NR3, CR3R4 ó SiR3R4, Y es CR5R6R7, SiR5R6R7, OR5, SR5 ó NHR5, R2 es H, OH, NHR8, SR8, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi, o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo o combinaciones de los mismos, o en la que: X es CR3R4R5, SiR3R4R5, OR3, SR3, o NHR3, R2 es H, OH, NHR6, SR6, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo o combinaciones de los mismos.

59. Kit según la reivindicación 58, en el que el nucleótido terminador 2' comprende un nucleósid.

2. monofosfato-3'hidroxilo.

60. Kit según la reivindicación 58, que comprende además uno o más nucleótidos extensibles.

61. Kit según la reivindicación 60, en el que por lo menos uno de los nucleótidos extensibles comprende un marcaje.

62. Kit según la reivindicación 61, en el que el marcaje comprende un isótopo radioactivo, un pigmento fluorescente

o un grupo modificador de la masa.

63. Kit según la reivindicación 58, que comprende además por lo menos una pirofosfatasa.

64. Kit según la reivindicación 58, que comprende además:

(c) un juego de instrucciones para extender el ácido nucleico utilizando el biocatalizador que incorpora nucleótidos y el nucleótido terminador 2' marcado.

65. Kit según la reivindicación 58, en el que el biocatalizador que incorpora nucleótidos comprende un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste de: una polimerasa, una transferasa terminal, una transcriptasa inversa, una polinucleótido fosforilasa y una telomerasa.

66. Kit según la reivindicación 65, en el que el enzima comprende una mutación que incrementa la incorporación de ribonucleótidos.

67. Kit según la reivindicación 65, en el que el enzima comprende una mutación que reduce o elimina la actividad de exonucleasa 5' a 3'.

68. Kit según la reivindicación 65, en el que el enzima comprende una mutación que incrementa la incorporación de análogo.

2. modificados de ribonucleótidos.

69. Kit según la reivindicación 65, en el que el enzima comprende una actividad de exonucleasa 3' a 5'.

70. Kit según la reivindicación 58, en el que el marcaje comprende un isótopo radioactivo, un pigmento fluorescente

o un grupo modificador de la masa.

71. Kit según la reivindicación 58, en el que el ácido nucleico comprende un cebador de ácidos nucleicos y el kit comprende además un ácido nucleico molde y el cebador de ácidos nucleicos, en el que el cebador de ácidos nucleicos es complementario respecto a por lo menos una subsecuencia del ácido nucleico molde.

72. Kit según la reivindicación 71, en el que el ácido nucleico molde o el cebador de ácidos nucleicos se une a un soporte sólido.

73. Kit según la reivindicación 71, en el que el cebador de ácidos nucleicos comprende un marcaje.

74. Kit según la reivindicación 73, en el que el marcaje comprende un isótopo radioactivo, un pigmento fluorescente

o un grupo modificador de la masa.

75. Sistema para extender un ácido nucleico, que comprende:

(a) por lo menos un recipiente que comprende un nucleótido terminador 2' marcado, y por lo menos uno de entre:

(b) por lo menos un modulador térmico operablemente conectado al recipiente para modular la temperatura 10 en el mismo, y

(c) por lo menos un componente de transferencia de líquidos que transfiere líquidos hacia y/o desde el recipiente,

en el que el nucleótido terminador 2' marcado comprende la fórmula:

en la que: R1 es OH, B es por lo menos un anillo homocíclico, por lo menos un anillo heterocíclico, por lo menos un grupo arilo, o combinaciones de los mismos, BG es un grupo bloqueante,

y Z es 0 0 CH2, y

representa un enlace sencillo o doble, en el que BG comprende la fórmula:

en la que: X es O, S, NR3, CR3R4 ó SiR3R4; Y es CR5R6R7, SiR5R6R7, OR5, SR5 ó NHR5,

R2 es H, OH, NHR8, SR8, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alcoxi o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, o combinaciones de los mismos, o en la que:

X es CR3R4R5, SiR3R4R5, OR3, SR3, o NHR3; R2 es H, OH, NHR6, SR6, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo

alquinilo, un grupo alcoxi o combinaciones de los mismos, y R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de entre H, un grupo alquilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo o combinaciones de los mismos.

76. Sistema según la reivindicación 75, que comprende además por lo menos un detector operablemente conectado 45 al recipiente para detectar señales detectables producidas en el recipiente.

77. Sistema según la reivindicación 75, que comprende además por lo menos un controlador operablemente conectado al modulador térmico para llevar a cabo la modulación de la temperatura en el recipiente y/o al componente de transferencia de líquidos para llevar a cabo la transferencia de líquido hacia y/o desde el recipiente.