MÉTODOS Y REACTIVOS PARA LA DETECCIÓN DE ASPERGILLUS SP.

Métodos y reactivos para la detección de Aspergillus sp.

El método se basa en el empleo de sondas específicas para las secciones Fumigati,

Nigri y Flavi del género Aspergillus, secciones de gran interés debido a que incluyen algunos de los patógenos más importantes del género. El método puede utilizarse para detectar secciones concretas de Aspergillus sp. en muestras ambientales, clínicas y alimentarias.

MÉTODOS Y REACTIVOS PARA LA DETECCIÓN DE ASPERGILLUS SP.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La invención se relaciona con un método in vitro para la detección de secciones del género Aspergillus mediante el empleo de sondas diseñadas para tal fin. Dicho método resulta de utilidad en la detección de hongos Aspergillus sp. en muestras ambientales, clínicas y alimentarias. Asimismo, la invención también se relaciona con un kit para la puesta en práctica de dicho método.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La mejoría en el manejo y tratamiento de pacientes quirúrgicos y médicos ha estado acompañada por un incremento en el número de infecciones que amenazan la salud del paciente debido a hongos oportunistas y patógenos. Los tratamientos contra el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) , la quimioterapia y las altas dosis de corticosteroides han contribuido al incremento del número de pacientes inmunodeprimidos. Muchos individuos inmunodeprimidos desarrollan infecciones oportunistas de hongos filamentosos saprofíticos, tales como las especies del género Aspergillus que se encuentran en el ambiente y que originalmente eran considerados de baja virulencia. Estas infecciones son con frecuencia fulminantes y fatales para individuos inmunodeprimidos.

El género Aspergillus se clasifica dentro de la División Ascomycota, Clase Eurotiomycetes, Orden Eurotiales, Familia Trichocomaceae. Fue descrito por primera vez en 1729 por el biólogo italiano Pier Antonio Micheli, quien usó el nombre de “Aspergillum” por parecerse el conidióforo de estos hongos al instrumento usado para dispersar agua bendita. Aspergillus es un género constituido por hongos filamentosos mitospóricos que se caracteriza por la producción de hifas especializadas, denominadas conidióforos, sobre los que se encuentran las células conidiógenas que originarán las esporas asexuales o conidios. El conidióforo característico de Aspergillus sp., aunque es una estructura unicelular, posee tres partes bien diferenciadas: vesícula, estipe y célula pie. Sobre la vesícula se disponen las células conidiógenas, denominadas habitualmente fiálides. En muchas especies, entre la vesícula y las fiálides se encuentran otras células denominadas métulas.

El género Aspergillus se dividió inicialmente en subgéneros y grupos, pero el sistema de clasificación actual sustituye la denominación de "grupo" por "sección " para ajustarse a las reglas del Código Internacional de Nomenclatura Botánica. Actualmente el género Aspergillus se divide en 8 subgéneros, que se subdividen a su vez en 18 secciones, aunque en los últimos años esta clasificación está siendo sometida a constantes revisiones debido a los análisis filogenéticos basados en características moleculares.

La gran importancia de este género de hongos radica no sólo en que es uno de los principales productores de micotoxinas, sino también en su capacidad de originar enfermedades infecciosas en animales y humanos y en la dificultad que existe hoy en día en su detección y discriminación temprana en un proceso infectivo.

El desarrollo de nuevos y específicos fármacos ha mejorado el control de las infecciones producidas por Aspergillus sp. Sin embargo, el diagnóstico continúa siendo difícil, debido a que los sistemas convencionales de detección y caracterización de especie por medio del cultivo del microorganismo y la observación tanto de su morfología macroscópica como microscópica son métodos muy lentos, que requieren de gran experiencia por parte del microbiólogo que lo lleva a cabo y además, no siempre son eficaces debido a la variabilidad fenotípica que puede mostrar una misma cepa en diversas condiciones.

El diagnóstico de infecciones fúngicas se realiza normalmente mediante el aislamiento del organismo infeccioso, por ensayos serológicos, o a través del examen histopatológico del tejido. El aislamiento de especies de Aspergillus en cultivo puede requerir varios días para adecuar el tratamiento y que ocurra la esporulación, retrasando el tratamiento adecuado, pues un cultivo positivo puede representar una colonización benigna en lugar de una invasión o infección.

Sin embargo, gracias a las técnicas moleculares se han desarrollado nuevos métodos de diagnóstico. En los últimos años muchos autores han desarrollado métodos de detección e identificación de Aspergillus sp. basados en la reacción en cadena de la polimerasa utilizando como diana diferentes regiones de los genes del ARN ribosómico (ADNr) 18S, 28S y 5, 8S. Estos genes contienen secuencias conservadas comunes a todos los hongos y también dominios variables, y regiones espaciadoras internas (ITS) entre ellos, altamente variables. Todas estas regiones tienen la ventaja de que se encuentran repetidas un alto número de veces en el genoma, y por lo tanto, su detección mediante PCR presenta una mayor sensibilidad.

Zhao et al. (2001) [Journal of Clinical Microbiology. 39 (6) : 2261-2266] han desarrollado sistemas de amplificación de las regiones ITS, por PCR anidada, llegando a diferenciar mediante electroforesis en gel de agarosa a A. fumigatus de otras especies del género, pero no de especies relacionadas de la sección Fumigati. La amplificación de las regiones ITS, principalmente las regiones ITSI e ITSII, seguida de secuenciación y análisis comparativo de la secuencia obtenida, es actualmente un método recomendado para la identificación de especies de Aspergillus a nivel de sección o complejo de especies (Balajee et al. 2007. Studies in Mycology. 59: 39-46) . Sin embargo, la identificación entre especies dentro de una misma sección es complicada, ya que las diferencias morfológicas y moleculares son pequeñas. Aún así, la identificación de Aspergillus a nivel de especie puede realizarse mediante la amplificación por PCR de dianas más específicas, como el gen de la ß-tubulina, seguido de un análisis comparativo de la secuencia amplificada (Balajee et al. y col, 2007, citado supra) .

La patente estadounidense US6372430 describe ácidos nucleicos para la detección de cinco especies diferentes de Aspergillus y otros hongos filamentosos, basados en la región ITSII.

Los sistemas utilizados actualmente para la detección e identificación de Aspergillus sp. como agente causal de un proceso infectivo o contaminación son normalmente poco efectivos, tediosos o conllevan un elevado coste. Por ello, existe la necesidad de desarrollar un sistema rápido, sencillo y sensible que permita, en un principio, la detección y diferenciación de Aspergillus sp. de otros géneros e incluso de secciones diferentes dentro del mismo género Aspergillus, partiendo de muestras de diversa procedencia.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de secciones del género Aspergillus en una muestra biológica que comprende

(a) extraer el ADN de dicha muestra biológica; y

(b) poner en contacto el ADN obtenido en la etapa (a) con una sonda seleccionada del grupo formado por un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, o cualquier combinación de dichas sondas,

en donde

(i) la hibridación de dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 con dicho ADN es indicativa de que el hongo pertenece al género Aspergillus, sección Fumigati;

(ii) la hibridación de dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 con dicho ADN es indicativa de que el hongo pertenece al género Aspergillus, sección Flavi; y

(iii) la hibridación de dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 con dicho ADN es indicativa de que el hongo pertenece al género Aspergillus, sección Nigri.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una sonda seleccionada del grupo formado por: i) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, y un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, ii) un polinucleótido que hibrida específicamente con un polinucleótido como el definido en i) ; y iii) cualquier combinación de polinucleótidos definidos en i) o ii) .

En otro aspecto, la invención se relaciona con una pareja de oligonucleótidos formada por un oligonucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada... [Seguir leyendo]

1. Método para la identificación de secciones del género Aspergillus en una muestra biológica que comprende

(a) extraer el ADN de dicha muestra biológica; y

(b) poner en contacto el ADN obtenido en la etapa (a) con una sonda seleccionada del grupo formado por un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, o cualquier combinación de dichas sondas,

en donde

(i) la hibridación de dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 con dicho ADN es indicativa de que el hongo pertenece al género Aspergillus, sección Fumigati;

(ii) la hibridación de dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 con dicho ADN es indicativa de que el hongo pertenece al género Aspergillus, sección Flavi; y

(iii) la hibridación de dicho polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 con dicho ADN es indicativa de que el hongo pertenece al género Aspergillus, sección Nigri.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende, además, entre las etapas (a) y (b) , la amplificación enzimática de un polinucleótido que comprende la totalidad

o parte de la región ITS de Aspergillus sp. a parir del ADN extraído de la etapa (a) .

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicha amplificación se lleva a cabo mediante el empleo de la pareja de cebadores cuyas secuencias de nucleótidos se muestran en SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha sonda comprende en su extremo 5’ un pigmento reportero y en su extremo 3’ un pigmento quencher.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en una muestra ambiental, una muestra clínica y una muestra alimentaria.

6. Una pareja de oligonucleótidos formada por un oligoucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 4 y un oligonucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 5.

7. Una sonda seleccionada del grupo formado por i) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, y un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3,

ii) un polinucleótido que hibrida específicamente con un polinucleótido como el definido en i) ; y iii) cualquier combinación de polinucleótidos definidos en i) o ii) .

8. Un kit que comprende, al menos, una sonda según la reivindicación 7, y, opcionalmente, una pareja de cebadores que amplifica específicamente un polinucleótido que comprende la totalidad o parte de la región ITS de Aspergillus sp.

9. Kit según la reivindicación 8, en el que dicha pareja de cebadores está formada por los oligonucleótidos cuyas secuencias de nucleótidos se muestran en SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

10. Kit según la reivindicación 8 ó 9, en el que dicha sonda comprende en su extremo 5’ un pigmento reportero y en su extremo 3’ un pigmento quencher.

11. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para la identificación de las secciones Fumigati, Flavi y Nigri del género Aspergillus en una muestra biológica.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en una muestra ambiental, una muestra clínica y una muestra alimentaria.

FIG. 1

FIG. 2

Zona de discrepancia

FIG. 2 (cont.)

FIG. 2 (cont.)

FIG. 3

FIG. 4

FIG. 5