Un polinucleótido aislado y purificado que consiste de un gen pds mutante de una cianobacteria que codifica un polipéptido que tiene Thr en la posición 175,

donde dicho gen pds mutante codifica resistencia a 4''-fluoro-6-[(alfa,alfa,alfa,-trifluoro-m-tolil)oxi)-picolinamida

Fragmentos de ácido nucleico de cianobacterias que codifican proteínas útiles para controlar rasgos de plantas mediante transformación nuclear o de plastoma.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con métodos de exploración para identificar y utilizar genes de cianobacterias para modificar rasgos de plantas, y a cianobacterias como una fuente alternativa de genes pds para transformaciones de plantas, en particular genes que codifican proteínas no sensibles a herbicidas, y elementos de genes para control de expresión en plástidos.

Aplicación relacionada

Esta aplicación reivindica prioridad de la Solicitud Provisional No. Serie 60/214,705, presentada el 27 de junio de 2000.

Antecedentes de la invención

Las cianobacterias son consideradas como las precursoras de los cloroplastos de plantas. Las cianobacterias poseen todas las características beneficiosas de los procariotes, tales como facilidad de manipulación, crecimiento rápido bajo condiciones definidas, disponibilidad de técnicas replicables sobre placa, fácil manipulación genética por mutagénesis o transformación y disponibilidad de mutantes establecidos. El metabolismo de las cianobacterias también comparte características importantes con metabolismos de plantas más avanzadas tales como fotosíntesis oxigénica por dos fotosistemas y autotrofía con respecto a nitrógeno reducido, azufre y dióxido de carbono. Por lo tanto, la eficiencia de compuestos en las cianobacterias puede ser indicativa de comportamiento similar en plantas más avanzadas.

Las membranas fotosintéticas de cianobacterias, plantas y algas contienen pigmentos esenciales llamados caroteniodes, los cuales funcionan protegiendo la clorofila contra daños fotooxidativos por oxígeno singlete, como también actuando como pigmentos accesorios en foto recepción fotosintética. Estos carotenoides también son precursores de vitamina A en humanos y de ácido abscísico en plantas. El primer paso comprometido en biosíntesis de carotenoides es la condensación de dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato (GGPP) para producir el fitoeno incoloro. La desaturación de fitoeno a través de la inserción de cuatro dobles enlaces da lugar a licopeno, y posteriores reacciones de ciclización dan lugar a la generación de ß-caroteno. El fitoeno desaturasa (pds) es mediador de los primeros dos pasos de desaturación de fitoeno, resultando la interrupción de ésta en un síntoma observable de decoloración. Como tal, se ha desarrollado un cierto número de herbicidas comerciales dirigidos a inhibir esta enzima, por ejemplo, norflurazon, fluridona y fluorocloridona.

Adicionalmente, como precursores ancestrales a los cloroplastos, los genes de cianobacteria comparten características comunes a genes de cloroplasto. Elementos del gen, tal como promotores, sitios de enlace ribosomal, etc. son similares y pueden tener funciones cruzadas entre cloroplastos y cianobacterias. Por lo tanto los genes de cianobacterias son candidatos ideales para transformación de plastoma objetivo, y en particular transformación del cloroplasto.

Existe un número de referencias en la literatura en cuanto a métodos de exploración y ensayos utilizando cianobacterias. Éstas incluyen métodos usando cianobacterias para la exploración de compuestos para identificar inhibidores de rutas metabólicas específicas e identificación de modos de acción herbicida novedosos. [Hirschberg et al, 1996] describe un gen Erwinia transformado en células huésped seleccionadas de cianobacterias, específicamente Synechococcus PCC 7942 y Synechocystis PCC 6803, el cual fue usado como una prueba para biosíntesis de beta-caroteno y para mutantes resistentes a herbicidas específicamente herbicidas blanqueadores de la familia trialquilamina. La prueba para la actividad blanquedora es descrita por [Sandmann et al, 1991] como medio para descubrir nuevos herbicidas con diferentes estructuras de núcleo las cuales inhiben el fitoteno desaturasa (pds), una enzima enlazada a una membrana en la ruta carotenogénica catalizando el paso de abstracción de hidrógeno en el primer precursor C40 de beta-caroteno. [Windhoevel et al, 1994] describe una prueba que involucra genes que codifican para pds de la bacteria no-fotosintética Erwinia uredovora que introduce en la cianobacteria Synechococcus como un modelo experimental conveniente para transformación de plantas avanzadas y resistencia a herbicidas. La funcionalidad del fitoeno desaturasa expresado de forma heteróloga en los transformantes fue demostrado en ensayos. Otras referencias tales como [Babczinski et al, 1995] identifican nuevas clases de herbicidas que inhiben pds basado en una prueba utilizando la cianobacteria unicelular Anacystis. [Chamowitz et al, 1993] describió un ensayo carotegénico libre de célula para identificar mutantes pds de algas resistentes a herbicida. La inhibición de biosíntesis de carotenoides por derivados m-fenoxibenzamida herbicidas fue investigado en un ensayo in vitro libre de células usando la cianobacteria Aphanocaspa por [Clarke et al, 1985], y subsecuentemente por (Kowalczyk-Schroeder et al, 1992]. [Sandmann et al. 1991], describe un ensayo no radioactivo libre de células para determinar cuantitativamente la inhibición de pds tipo planta por herbicidas blanqueadores. Ellos desarrollaron posteriormente un sistema ensayo pds de cianobacteria, un ensayo modo de acción utilizando la cianobacteria Anacystis, y ensayos usando células de algas. La presente invención, sin embargo, se diferencia identificando mejoras a los métodos actuales de prueba y ensayos, y usa éstas mejoras para identificar fragmentos novedosos de ácido nucleico teniendo mutaciones de resistencia a herbicida en el gen pds.

La enzima acetolactato sintasa procariótica (ahas) existe como dos subunidades de proteína distintas, pero físicamente asociadas. En procariotes, los dos polipéptidos, una "subunidad grande" y una "subunidad pequeña" son expresados de genes separados. Tres enzimas ahas principales, designadas I, II, III, todas teniendo subunidades grandes y pequeñas han sido identificadas en bacteria entérica. En procariotes, se ha mostrado que la enzima ahas es una enzima reguladora en la ruta biosintética de amino ácido ramificado [Miflin et al, 1971], y solamente se ha observado actividad catalizadora en la subunidad grande. De estudios de enzimas ahas de sistemas microbianos, se han descrito dos funciones para la subunidad pequeña: 1) la subunidad pequeña está involucrada en la inhibición de retroalimentación alostérica de la subunidad grande catalizadora cuando en la presencia de isoleucina, leucina o valina o combinaciones del mismo; y 2) la pequeña subunidad mejora la actividad de la subunidad grande en la ausencia de isoleucina, leucina o valina. También se ha mostrado que la pequeña subunidad incrementa la estabilidad de la conformación activa de la subunidad grande. La expresión de la pequeña subunidad también puede aumentar la expresión de la subunidad grande como es visto para AHASI de E. coli [Weinstock et al., 1992].

La subunidad grande de proteína ahas ha sido identificada en plantas, y también ha sido aislada y usada para transformar plantas. Un isotipo alelo mutante ahas de la subunidad grande de proteína ahas III, teniendo el triptófano en posición 557 remplazado con leucina ha sido encontrado en una línea celular Brassica napus [Hattori et al., 1995]. El producto de proteína mutante de éste gen confiere resistencia de la línea celular a sulfonilurea, imidazolinona y triazolopiridina. Este alelo mutante, cuando es expresado en plantas transgénicas, también confiere resistencia a estos herbicidas.

Hasta recientemente, no había evidencia directa de que una pequeña subunidad de proteína de ahas existiera en organismos eucarióticos. Recientemente, otros grupos, a través del uso de Etiquetas de Secuencia Expresadas (ESTs), han identificado secuencias homólogas a los genes de pequeñas unidades ahas microbianos en un eucarionte, la planta Arabidopsis. Estos grupos mostraron que una secuencia cADN Arabidopsis aleatoriamente aislada tenía homología de secuencia con las secuencias de la pequeña subunidad ahas de los sistemas microbianos. Desde entonces, ESTs de genes de pequeñas subunidades han sido descritos de otros eucariontes tales como levadura y algas rojas. [Duggleby et al, 1997] describe tres secuencias EST, dos de Arabidopsis...

1. Un polinucleótido aislado y purificado que consiste de un gen pds mutante de una cianobacteria que codifica un polipéptido que tiene Thr en la posición 175, donde dicho gen pds mutante codifica resistencia a 4'-fluoro-6-[(alfa,alfa,alfa,-trifluoro-m-tolil)oxi)-picolinamida.

2. Un polinucleótido aislado y purificado de acuerdo a la reivindicación 1, donde dicha cianobacteria es seleccionada del grupo que consiste de Synechocystis PCC 6803 y Anabaena PCC 7120.

3. Un polinucleótido aislado y purificado que consiste de un gen pds mutante, donde dicho gen pds mutante tiene una mutación de un cambio de par de bases de guanina a adenina en la posición 642 de dicho gen pds mutante.

4. Un polinucleótido aislado y purificado de acuerdo a la reivindicación 3, donde el polinucleótido puede ser aislado de una cianobacteria seleccionada del grupo que consiste de Synechocystis PCC 6803 y Anabaena PCC 7120.

5. Un polinucleótido aislado y purificado de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho gen pds mutante tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO. 3.

6. Un polinucleótido aislado y purificado de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicho gen pds mutante codifica resistencia cruzada a un grupo que consiste de (2E) [amino(benzilsulfanil)metileno]-1-(2,4-diclorofenil)-1,3-butanodiona, piridina, 2-[(3,3-dicloro-2-propenil)oxil-4-metil-6-[[2-(trifluorometil)-4-pirodinil]oxil y 1,2,4,5-bencenotetracarboxamida,N,N',N'',N'''-tetraquis[5-(benzoilamino)-9,10-dihidro-9,10-dioxo-1-antracenil].

7. Un vector de expresión replicable que comprende la secuencia polinucleotídica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un genoma nuclear que comprende el vector de expresión replicable de la reivindicación 7.

9. Un plastoma que comprende el vector de expresión replicable de la reivindicación 7.

10. Una planta transgénica que comprende la secuencia polinucleotídica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. Una planta transgénica de acuerdo a la reivindicación 10, donde dicha planta transgénica exhibe resistencia a herbicidas seleccionados del grupo que consiste de 4'-fluoro-6-[(alfa,alfa,alfa,-trifluoro-m-tolil)oxi)-picolinamida, (2E) [amino(benzilsulfanil)metileno]-1-(2,4-diclorofenil)-1,3-butanodiona, piridina, 2-[(3,3-dicloro-2-propenil)oxil-4-metil-6-[[2-(trifluorometil)-4-pirodinil]oxil y 1,2,4,5-bencenotetracarboxamida,N,N',N'',N'''-tetraquis[5-(benzoila- mino)-9,10-dihidro-9,10-dioxo-1-antracenil].

12. Progenie derivada de la planta transgénica de acuerdo a la reivindicación 10 o a la reivindicación 11, caracterizada porque dicha progenie comprende la secuencia polinucleotídica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

13. Un marcador seleccionable para transformación que comprende un gen pds mutante de cianobacteria que contiene el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

14. Un proceso para la selección de nuevos rasgos tales como resistencia a herbicidas que comprenden el uso de un gen pds mutante de cianobacteria de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, emparejado con la selección de inhibidores PDS.

15. Un proceso para la selección de nuevos rasgos de acuerdo a la reivindicación 14, donde dicho inhibidor PDS es 4'-fluoro-6-[(alfa,alfa,alfa,-trifluoro-m-tolil)oxi)-picolinamida.