MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA DETERMINACIÓN DE LA DIVERSIDAD DEL REPERTORIO DE LINFOCITOS T DE UN INDIVIDUO.

Métodos y composiciones para la determinación de la diversidad del repertorio de linfocitos T de un individuo.

La presente invención se abarca dentro del campo de la biotecnología. De manera específica, la invención se relaciona con un método para determinar la diversidad del repertorio de linfocitos T de un individuo. La invención también se relaciona con un método para la monitorización de la evolución de una patología en un paciente en respuesta a un tratamiento. Asimismo, la invención también se relaciona con composiciones para llevar a cabo dicho método, que comprenden una pluralidad de cebadores sentido, que hibridan específicamente con el segmento v de un gen que codifica una cadena β del TCR y un cebador antisentido marcado con una primera etiqueta detectable, que hibrida específicamente con el segmento C del gen que codifica la cadena β del TCR y un segundo cebador antisentido que hibrida específicamente con la misma región que el primer cebador antisentido y que está marcado con una segunda etiqueta detectable.

Métodos y composiciones para la determinación de la diversidad del repertorio de linfocitos T de un individuo.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se relaciona con un método para determinar la diversidad del repertorio de linfocitos T de un individuo, así como con composiciones para llevar a cabo dicho método.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El receptor de células T (TCR) es la molécula que interviene en el reconocimiento antigénico y que proporciona a dichas células su capacidad de discriminación. La variabilidad en las cadenas del TCR está centralizada en la región de unión del péptido antigénico, que está codificada por los segmentos génicos V y J en la cadena α, o V, D y J en la cadena β. Durante el proceso de recombinación somática se genera la diversidad estructural del repertorio de TCR, que adicionalmente se incrementa por deleción en dichos segmentos y por inserción de nucleótidos no germinales. Las regiones génicas resultantes codifican para los bucles CDR3, que serán de longitud variada y que forman el centro del sitio de unión a antígeno. Los TCR, al contrario que las inmunoglobulinas, no sufren hipermutación somática y, por tanto, toda la diversidad se concentra en los CDR3.

Se han observado perturbaciones en el repertorio de TCR en sujetos infectados con HIV-1, posiblemente como reflejo de respuestas de linfocitos T citotóxicos (en inglés cytotoxic T lymphocyte, CTL) enérgicas pero no completamente efectivas, compuestas principalmente por células T CD8 resultantes de una expansión oligoclonal que comparten determinantes antigénicos comunes. Estas perturbaciones ocurren frecuentemente bien por expansión clonal de células T o por deleción en una o más familias de Vβ. Se han observado expansiones clonales múltiples o persistentes de células T CD8 en individuos con infecciones por VIH-1 crónica o progresiva.

La infección por HIV-1 induce perturbaciones en el repertorio de receptores de células T periféricas durante la infección primaria. Se ha postulado que las perturbaciones se deben a la expansión clonal y agotamiento de los clones de células T específicos de HIV-1 durante la viremia inicial después de infección aguda (Pantaleo et al., 1994, Nature 370:463-7) . Aunque existe controversia al respecto, algunos estudios han observado que una terapia antirretroviral efectiva no reconstituye completamente al repertorio de células T que ha sido perturbado (Yin et al., 2008, Clin Vaccine Immunol 2009; 1293-1301; Yin et al., 2008, J. Allergy Clin. Immunol 122:166-72) .

Las respuestas específicas de epítopo son la suma de clones respondedores individuales de células T y probablemente sea necesario un repertorio de TCRs estructuralmente diverso para la óptima eliminación de la viremia en infecciones con capacidad de desarrollar mutaciones de escape rápidamente. Una matriz variada de TCRs podría reducir la probabilidad de escape de CTLs debido al reconocimiento cruzado de epítopos mutados y además es más probable que contenga clones de células T de alta afinidad capaces de reconocer epítopos específicos de manera eficiente y, por lo tanto, mediar en un mejor control de la replicación del virus.

Las expansiones oligoclonales y eliminaciones dentro de las subpoblaciones de células T se pueden medir mediante el análisis de la región hipervariable CDR3 del TCR (Raaphorst et al., 2002, Hum. Immunol. 63:51-60) . Variación de la longitud del CDR3 refleja los cambios en el repertorio TCRVβ durante la infección por VIH-1

La variación en la longitud de los CDR3 es la base de la técnica de “spectratyping”, donde dicha región se amplifica y la distribución de las diferentes longitudes es un indicador de la variedad del repertorio de TCR. Esta técnica es útil para detectar expansiones clonales en respuesta a ciertas situaciones patológicas, como por ejemplo con células T infiltradas en tumor (Puisieux et al., 1994, J. Immunol. 153:2807-2818) , o analizar variaciones que puedan ocurrir en el repertorio durante el transcurso de ciertas enfermedades, como inmunodeficiencias o enfermedades autoinmunes.

Una dificultad asociada a esta técnica es el alto número de reacciones necesarias y una interpretación de los resultados complicada. En Monteiro et al. (Monteiro et al., 1995, Mol. Med. 1:614-624) se describe un método de spectratyping del CDR3 del TCR por PCR en formato multiplex que consta de 26 cebadores específicos para las familias de genes Vβ y un cebador específico para la región constante Cβ, éste marcado radiactivamente. La combinación de 2 ó 3 cebadores de genes Vβ con el cebador Cβ en un solo tubo permite el análisis de las 26 familias de genes Vβ en 12 reacciones de PCR. En una aproximación diferente, el empleo de 27 cebadores específicos para las familias de genes Vβ y un cebador específico para la región constante Cβ marcado con un fluorocromo, hace que las reacciones de PCR se efectúen a cabo de forma individual para cada familia de genes Vβ ( Chen et al., 2005, Blood 105:886-93) .

En US 2007/0117134 se describe un método para detectar expansiones clonales de los linfocitos T a partir de DNA genómico. Está basado en el uso de 118 cebadores únicos, altamente específicos y no solapantes, que incluyen 22 cebadores específicos para regiones Vβ, 13 cebadores específicos para regiones Jβ y Cβ, y cebadores anidados, tanto para genes del TCR humano como murino.

En US 2011/0003291 se describe un método de análisis de la diversidad del repertorio de linfocitos T y/o B por medio de PCR multiplex. El número total de cebadores definidos es de 119, los cuáles son específicos para regiones de los genes V o D, y J, de forma que permiten la detección de los reordenamientos V (D) J o D-J.

Con el propósito de reducir el número de reacciones de PCR, Fernandes et al. desarrollaron un sistema para spectratyping por PCR multiplex para la evaluación del repertorio de la cadena β del TCR (Fernandes et al., 2005, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12:477-83) . Su sistema consta de 24 cebadores específicos para cada uno de los genes de las regiones variable Vβ más importantes, que están marcados con un fluorócromo (elegido de entre tres fluorocromos) , y un cebador específico para la región constante Cβ sin marcar. Este método ofrece la ventaja de reducir el número de reacciones de PCR a 7, de las 12 requeridas con el método que utiliza el cebador de Cβ marcado (Monteiro et al., supra.) .

Existe, por tanto, en la técnica la necesidad de métodos y composiciones que permitan reducir el número de reacciones necesarias para la evaluación del repertorio de linfocitos T y la interpretación de los resultados.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la invención se relaciona con una composición o kit para analizar el repertorio de células T en una muestra que comprende:

(i) una pluralidad de cebadores sentido, donde cada uno de dichos cebadores se hibrida específicamente con el segmento V de un gen que codifica una cadena β del TCR,

(ii) un primer cebador antisentido marcado con una primera etiqueta detectable, donde dicho cebador hibrida específicamente con el segmento C del gen que codifica la cadena β del TCR y,

(iii) un segundo cebador antisentido que hibrida específicamente con la misma región que el cebador (ii) , que está marcado con una segunda etiqueta detectable.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para analizar el repertorio de células T en una muestra que comprende las etapas de

(i) amplificar una preparación de ADNc obtenida a partir de ARN aislado de dicha muestra usando una multiplicidad de cebadores sentido, donde cada uno de dichos cebadores hibrida específicamente con el segmento V del gen que codifica la cadena β del TCR y dos cebadores antisentido que hibridan específicamente con la región constante Cβ del TCR en donde cada uno de dichos cebadores sentido se encuentra marcado con una etiqueta detectable distinta, y

(ii) analizar el número de productos de amplificación obtenidos en la etapa anterior.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la composición o kit, o del método de los aspectos anteriores en el diagnóstico de una patología.

En un último aspecto, la invención se relaciona con un método para la monitorización de la evolución de una patología en un paciente en respuesta a un tratamiento que comprende determinar la complejidad del repertorio de células T en una muestra de dicho paciente tras ser sometido a dicho tratamiento, en donde un aumento de la complejidad de dicho repertorio con respecto a la complejidad... [Seguir leyendo]

1. Composición o kit para analizar el repertorio de células T en una muestra que comprende i) una pluralidad de cebadores sentido, donde cada uno de dichos cebadores hibrida específicamente con el segmento V de un gen que codifica una cadena β del TCR, ii) un primer cebador antisentido marcado con una primera etiqueta detectable, donde dicho cebador hibrida específicamente con el segmento C del gen que codifica la cadena β del TCR y, iii) un segundo cebador antisentido que hibrida específicamente con la misma región que el cebador (ii) ,

que está marcado con una segunda etiqueta detectable. en donde la pluralidad de cebadores sentido comprende 24 cebadores que hibridan de forma específica con un segmento V que forma parte del gen que codifica para la cadena β de los TCRs 2, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1, 7.1, 9, 10.1, 11, 12.3, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 23 24, 25, 27, 28, 29 y 30, y que dichos cebadores sentido comprenden las secuencias identificadas en SEQ ID NO:1 a 24 o variantes de dichas secuencias que conservan la capacidad de hibridar específicamente con cada uno de los segmentos V que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR con los que hibridan las secuencias identificadas en SEQ ID NO:1 a 24, y en donde el primer y el segundo cebadores antisentido comprenden la secuencia SEQ ID NO:25 o variantes de dicha secuencia que conservan la capacidad de hibridar específicamente con la misma región del segmento C del gen que codifica la cadena β del TCR que la secuencia identificada en SEQ ID NO:25.

2. Composición o kit según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde los cebadores se encuentran agrupados en 8 contenedores distintos, en donde los distintos contenedores contiene

(i) los cebadores que comprenden las secuencias SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:17 y el cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO:25 marcado con 5-FAM o variantes de dichos cebadores que conservan la capacidad de hibridar específicamente con cada uno de los segmentos V o C correspondientes que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR;

(ii) los cebadores que comprenden las secuencias SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:22 y el cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO:25 marcado con TAMRA o variantes de dichos cebadores que conservan la capacidad de hibridar específicamente con cada uno de los segmentos V o C correspondientes que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR;

(iii) los cebadores que comprenden las secuencias SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:20 y el cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO:25 marcado con 5-FAM o variantes de dichos cebadores que conservan la capacidad de hibridar específicamente con cada uno de los segmentos V o C correspondientes que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR;

(iv) los cebadores que comprenden las secuencias SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:24 y el cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO:25 marcado con TAMRA o variantes de dichos cebadores que conservan la capacidad de hibridar específicamente con cada uno de los segmentos V o C correspondientes que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR;

(v) los cebadores que comprenden las secuencias SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:19 y el cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO:25 marcado con 5-FAM o variantes de dichos cebadores que conservan la capacidad de hibridar específicamente con cada uno de los segmentos V o C correspondientes que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR;

(vi) los cebadores que comprenden las secuencias SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:23 y el cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO:25 marcado con TAMRA o variantes de dichos cebadores que conservan la capacidad de hibridar específicamente con cada uno de los segmentos V o C correspondientes que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR;

(vii) los cebadores que comprenden las secuencias SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:18 y el cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO:25 marcado con 5-FAM o variantes de dichos cebadores que conservan la capacidad de hibridar específicamente con cada uno de los segmentos V o C correspondientes que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR y

(viii) los cebadores que comprenden las secuencias SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:21 y el cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO:25 marcado con TAMRA o variantes de dichos cebadores que conservan la capacidad de hibridar específicamente con cada uno de los segmentos V o C correspondientes que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR.

3. Composición o kit según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos un cebador adicional que hibrida con el segmento C del gen que codifica para la cadena β del TCR.

4. Composición o kit según la reivindicación 3, donde la secuencia de dicho al menos un cebador adicional comprende SEQ ID NO:26 y/o SEQ ID NO:27 o variantes de dichos cebadores que conservan la capacidad de hibridar específicamente con dichas regiones constantes segmento C del gen que codifica la cadena β del TCR.

5. Composición o kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende -los reactivos necesarios para amplificar ADNc, y/o -los reactivos necesarios para realizar reacciones de transcripción reversa de ARN.

6. Método para analizar el repertorio de células T en una muestra que comprende las etapas de

(i) amplificar una preparación de ADNc obtenida a partir de ARN aislado de dicha muestra usando una multiplicidad de cebadores sentido, donde cada uno de dichos cebadores hibrida específicamente con el segmento V del gen que codifica la cadena β del TCR y dos cebadores antisentido que hibridan específicamente con la región constante Cβ del TCR en donde cada uno de dichos cebadores antisentido se encuentra marcado con una etiqueta detectable distinta, y

(ii) analizar el número de productos de amplificación obtenidos en la etapa (i) , en donde la pluralidad de cebadores sentido comprende 24 cebadores que hibridan de forma específica con un segmento V que forma parte del gen que codifica para la cadena β de los TCRs 2, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1, 7.1, 9, 10.1, 11, 12.3, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 23 24, 25, 27, 28, 29 y 30, y que dichos cebadores sentido comprenden las secuencias identificadas en SEQ ID NO:1 a 24 o variantes de dichos secuencias que conservan la capacidad de hibridar específicamente con cada uno de los segmentos V que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR con los que hibridan las secuencias identificadas en SEQ ID NO:1 a 24, y en donde los dos cebadores antisentido comprenden la secuencia SEQ ID NO:25 o variantes de dicha secuencia que conservan la capacidad de hibridar con una secuencia específica del segmento C del gen que codifica la cadena β del TCR.

7. Método según la reivindicación 8 en donde la amplificación de la etapa (i) se lleva a cabo en varias reacciones usando en cada una de las reacciones parejas de cebadores sentido-antisentido que dan lugar a productos de amplificación que son distinguibles del resto de productos de amplificación obtenidos en la misma reacción en base al tamaño y/o en base a la etiqueta detectable.

8. Método según la reivindicación 9 en donde las parejas de cebadores sentido-antisentido se agrupan en 8 reacciones de PCR multiplex.

9. Método según la reivindicación 8 en donde cada una de las reacciones de PCR multiplex comprende -al menos un cebador sentido con secuencia identificada en SEQ ID NO:1 a 8, o variantes de las mismas que conservan la capacidad de hibridar específicamente cada uno de segmentos V correspondientes que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR, -al menos un cebador sentido con secuencia identificada en SEQ ID NO:9 a 16, o variantes de las mismas que conservan la capacidad de hibridar específicamente cada uno de segmentos V correspondientes que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR, -al menos un cebador sentido con secuencia identificada en SEQ ID NO:17 a 24, o variantes de las mismas que conservan la capacidad de hibridar específicamente cada uno de segmentos V correspondientes que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR, y

- un cebador antisentido con secuencia identificada en SEQ ID NO:25 marcado con 5-FAM o SEQ ID NO:25 marcado con TAMRA.

10. Método según la reivindicación 9 en donde cada una de las reacciones de PCR multiplex se lleva a cabo usando las siguientes combinaciones de cebadores -R1: SEQ ID NO:1 + SEQ ID NO:11 + SEQ ID NO:17 + SEQ ID NO:25 marcado con 5-FAM; -R2: SEQ ID NO:5 + SEQ ID NO:13 + SEQ ID NO:22 + SEQ ID NO:25 marcado con TAMRA; -R3: SEQ ID NO:2 + SEQ ID NO:9 + SEQ ID NO:20 + SEQ ID NO:25 marcado con 5-FAM; -R4: SEQ ID NO:6 + SEQ ID NO:14 + SEQ ID NO:24 + SEQ ID NO: NO:25 marcado con TAMRA; -R5: SEQ ID NO:3 + SEQ ID NO:10 + SEQ ID NO:19 + SEQ ID NO:25 marcado con 5-FAM; -R6: SEQ ID NO:7 + SEQ ID NO:15 + SEQ ID NO:23 + SEQ ID NO: NO:25 marcado con TAMRA; -R7: SEQ ID NO:4 + SEQ ID NO:12 + SEQ ID NO:18 + SEQ ID NO:25 marcado con 5-FAM; -R8: SEQ ID NO:8 + SEQ ID NO:16 + SEQ ID NO:21 + SEQ ID NO: NO:25 marcado con TAMRA,

o variantes de dichos cebadores que conservan la capacidad de hibridar específicamente con cada uno de segmentos V o C correspondientes que forman parte del gen que codifica para la cadena β del TCR.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 en donde el análisis de los productos de amplificación obtenidos de la etapa (ii) se lleva a cabo mediante determinación del tamaño y/o del marcaje de cada uno de los productos de amplificación obtenido en cada una de las reacciones de amplificación.

12. Método según la reivindicación 11 en donde los productos de amplificación obtenidos en cada una de las reacciones de amplificación se combinan de acuerdo al tamaño y/o del marcaje.

13. Método según la reivindicación 12 en donde dicha combinación se lleva a cabo a partir de los productos de amplificación obtenidos de las reacciones R1 y R2, los productos de amplificación obtenidos de las reacciones R3 y R4, los productos de amplificación obtenidos de las reacciones R5 y R6 y los productos de amplificación obtenidos de las reacciones R7 y R8.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una amplificación adicional del ADNc empleando al menos un cebador adicional que hibrida con el segmento C del gen que codifica para la cadena β del TCR.

15. Método según la reivindicación 14, donde la secuencia de dicho al menos un cebador adicional comprende SEQ ID NO:26 y/o SEQ ID NO:27, o variantes de dichos cebadores que conservan la capacidad de hibridar específicamente con la región correspondiente del segmento C del gen que codifica para la región constante de la cadena β del TCR.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15 en donde la muestra es una muestra de sangre periférica.

17. Método según la reivindicación 16 en donde dicha muestra es una muestra de sangre periférica enriquecida en células CD4+ o CD8+.

18. Uso de la composición o kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o del método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17, en el diagnóstico de una patología.

19. Método para la monitorización de la evolución de una patología en un paciente en respuesta a un tratamiento que comprende determinar la complejidad del repertorio de células T en una muestra de dicho paciente tras ser sometido a dicho tratamiento usando un método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17, en donde un aumento de la complejidad de dicho repertorio con respecto a la complejidad antes de iniciar el tratamiento es indicativo de que el paciente responde a dicho tratamiento.

20. Método según la reivindicación 19 en donde dicha patología es una inmunodeficiencia.

21. Método según la reivindicación 20 en donde dicha inmunodeficiencia es el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o una patología asociada a la infección por VIH.

22. Método según las reivindicaciones 19 o 20 en donde la terapia es TARGA.

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