Métodos para simplificar ácidos nucleicos microbianos mediante modificación química de citosinas.

Un método para detectar un microorganismo que comprende:

reducir la complejidad de un genoma microbiano o de un ácido nucleico microbiano mediante la generaciónde una forma derivada del genoma microbiano o de una forma derivada del ácido nucleico microbiano en elque las posiciones ocupadas naturalmente por citosinas están ocupadas por uracilos en la forma derivadadel genoma microbiano o forma derivada del ácido nucleico microbiano mediante el tratamiento del genomamicrobiano o un ácido nucleico microbiano con un agente seleccionado entre bisulfito,

acetato o citrato quemodifica la citosina a uracilo;

donde la forma derivada del genoma microbiano o la forma derivada del ácido nucleico microbianocontienen un ácido nucleico que es específico para un microorganismo que tiene el genoma microbiano o elácido nucleico microbiano, y

detectar el ácido nucleico específico microbiano, en donde la detección del ácido nucleico específicomicrobiano es indicativa de la presencia de un microorganismo que tiene el genoma microbiano o el ácidonucleico microbiano.

Métodos para simplificar ácidos nucleicos microbianos mediante modificación química de citosinas

Campo técnico

La invención se refiere a análisis de detección de ácidos nucleicos para la detección de microorganismos. La invención también se refiere a métodos para el tratamiento químico de los ácidos nucleicos para reducir la complejidad de los genomas microbianos combinados con el uso de ligandos específicos para la detección microbiana.

Técnica anterior

En la actualidad se encuentran disponibles diversos procedimientos para la detección de moléculas de ácido nucleico específicas. Estos procedimientos dependen típicamente de la hibridación dependiente de la secuencia entre el ácido nucleico diana y sondas de ácido nucleico que pueden tener una longitud que varía de oligonucleótidos cortos (20 bases o menos) a secuencias de muchas kilobases (kb) .

El método más ampliamente utilizado para la amplificación de secuencias específicas dentro de una población de secuencias de ácido nucleico es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Dieffenbach, C y Dveksler, G. eds. PCR Primer: A Laborator y Manual. Cold Spring Harbor Press, Plainview NY) . En este método de amplificación, se utilizan oligonucleótidos, generalmente de 20 a 30 nucleótidos de longitud en cadenas de ADN complementarias y en cada extremo de la región que se va a amplificar, para cebar la síntesis de ADN sobre ADN de hebra sencilla desnaturalizado. Ciclos sucesivos de desnaturalización, hibridación de cebadores, y síntesis de hebras de ADN usando ADN polimerasas termoestables permiten la amplificación exponencial de las secuencias entre los cebadores. Las secuencias de ARN se pueden amplificar por medio de una primera copia utilizando la transcriptasa inversa para producir una copia de ADN complementario (ADNc) . Se pueden detectar fragmentos de ADN amplificados mediante una variedad de métodos, incluyendo la electroforesis en gel, la hibridación con sondas marcadas, el uso de cebadores etiquetados que permiten la identificación posterior (por ejemplo, mediante un análisis con enzima ligada) , y el uso de cebadores marcados con fluorescencia que dan lugar a una señal tras la hibridación con el ADN diana (por ejemplo, sistemas de Beacon y TaqMan) .

Junto con la PCR, se ha desarrollado una variedad de técnicas distintas para la detección y amplificación de secuencias de nucleótidos específicas. Un ejemplo es la reacción en cadena de la ligasa (1991, Barany, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 189-193) .

Otro ejemplo es la amplificación isotérmica que se describió por primera vez en 1992 (Walker GT, Little MC, Nadeau JG y Shank D. Isotermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396 (1992) y se denominó amplificación con desplazamiento de la hebra (SDA) . Desde entonces, se han descrito otras diversas tecnologías de amplificación isotérmica incluyendo Amplificación Mediada por Transcripción (TMA) y Amplificación Basada en Secuencias de Ácido Nucleico (NASBA) que utilizan una ARN polimerasa para copiar secuencias de ARN pero no el ADN genómico correspondiente (Guatelli JC, Whitfield KM, Kwoh DY, Barringer KJ, Richmann DD y Gingeras TR. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. PNAS 87: 1874-1878 (1990) : Kievits T, van Gemen B, van Strijp D, Schukkink R, Dircks M, Adriaanse H, Malek L, Sooknanan R, Lens P. NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection. J Virol Methods. 1991 Dec; 35 (3) :273-86) .

Otras técnicas isotérmicas basadas en el ADN incluyen la amplificación mediante círculo rodador (RCA) en la que una ADN polimerasa prolonga un cebador dirigido a un molde circular (Fire A y Xu SQ. Rolling replication of short circles. PNAS 92: 4641-4645 (1995) , Ramificación-Amplificación (RAM) que utiliza una sonda circular para la detección de la diana (Zhang W, Cohenford M, Lentrichia B, Isenberg HD, Simson E, Li H, Yi J, Zhang DY. Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study. J Clin Microbiol. 2002 Jan; 40 (1) :128-32.) y más recientemente, amplificación de ADN isotérmica dependiente de helicasa (HDA) , que utiliza una enzima helicasa para desenrollar las hebras de ADN en lugar de calor (Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004 Aug; 5 (8) :795-800.)

Recientemente, se han descrito métodos de amplificación isotérmica de ADN (Walker GT, Little MC, Nadeau JG y Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392396 (1992) . Las técnicas tradicionales de amplificación se basan en ciclos continuos de desnaturalización y renaturalización de las moléculas diana en cada ciclo de la reacción de amplificación. El tratamiento térmico del ADN da como resultado un cierto grado de cizallamiento de las moléculas de ADN, con lo que cuando el ADN es limitante como en el aislamiento de ADN a partir de un pequeño número de células de un blastocisto en desarrollo, o en particular en los casos en los que el ADN está ya en una forma fragmentada, por ejemplo en secciones de tejido, bloques de parafina y muestras de ADN antiguas, este ciclo de calentamiento-enfriamiento adicional podría dañar el ADN y dar como resultado la pérdida de señales de amplificación. Los métodos isotérmicos no se basan en la desnaturalización continua del ADN molde para producir moléculas de hebra sencilla que sirvan como moldes a partir de una amplificación adicional, sino en la formación de mellas enzimáticas de moléculas de ADN mediante endonucleasas de restricción específicas a una temperatura constante.

La técnica denominada amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) se basa en la capacidad de ciertas enzimas de restricción para formar una mella en la hebra de ADN hemi-modificada y la capacidad de una polimerasa carente de exonucleasa 5'-3' para ampliar y desplazar la hebra aguas abajo. La amplificación exponencial se consigue a continuación mediante el acoplamiento de reacciones efectoras y antisentido en las que el desplazamiento de la hebra de la reacción efectora sirve como molde para la reacción antisentido (Walker GT, Little MC, Nadeau JG y Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396 (1992) . Dichas técnicas se han utilizado para la amplificación satisfactoria de Mycobacterium tuberculosis (Walker GT, Little MC, Nadeau JG y Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396 (1992) , HIV-1, Hepatitis C and HPV-16 Nuovo G. J., 2000) , Chlamydia trachomatis (Spears PA, Linn P, Woodard DL y Walker GT. Simultaneous Strand Displacement Amplification and Fluorescence Polarization Detection of Chlamydia trachomatis. Anal. Biochem. 247: 130-137 (1997) .

El uso de SDA hasta la fecha ha dependido de nucleótidos modificados con fosforotioato con el fin de producir un dúplex de ADN-hemi-fosforotioato que en la hebra modificada sería resistente a la escisión por la enzima, dando como resultado la formación enzimática de mellas en lugar de la digestión para conducir la reacción de desplazamiento. Recientemente, sin embargo, se han diseñado varias enzimas "nickasa". Estas enzimas no cortan el ADN de la manera tradicional sino que producen una mella en una de las hebras de ADN. Las enzimas "nickasa" incluyen N.Alw1 (Xu Y, Lunnen KD y Kong H. Engineering a nicking endonuclease N.Alw1 by domain swapping. PNAS 98: 12990-12995 (2001) , N.BstNB1 (Morgan RD, Calvet C, Demeter M, Agra R, Kong H. Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI. Biol Chem. 2000 Nov; 381 (11) :1123-5.) y Mly1 (Besnier CE, Kong H. Converting Mlyl endonuclease into a nicking enzyme by changing its oligomerization state. EMBO Rep. 2001 Sep;2 (9) :782-6. Epub 2001 Aug 23) . El uso de tales enzimas simplificaría de ese modo el procedimiento SDA.

Además, la SDA se ha mejorado mediante el uso de una combinación de una enzima de restricción estable al calor (Ava1) y una Exo-polimerasa estable al Calor (polimerasa Bst) . Se ha demostrado que esta combinación aumenta la eficiencia de amplificación de la reacción de una amplificación de 108 veces a una amplificación de 1010 veces de manera que es posible, usando esta técnica, la amplificación de moléculas únicas de copia única. El factor de amplificación resultante usando la combinación polimerasa/enzima estable al calor es del orden de 109 (Milia M. A., Spears P. A., Pearson R. E. y Walker G. T. Use of the Restriction Enzyme Ava1 and Exo-Bst... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar un microorganismo que comprende:

reducir la complejidad de un genoma microbiano o de un ácido nucleico microbiano mediante la generación de una forma derivada del genoma microbiano o de una forma derivada del ácido nucleico microbiano en el que las posiciones ocupadas naturalmente por citosinas están ocupadas por uracilos en la forma derivada del genoma microbiano o forma derivada del ácido nucleico microbiano mediante el tratamiento del genoma microbiano o un ácido nucleico microbiano con un agente seleccionado entre bisulfito, acetato o citrato que modifica la citosina a uracilo;

donde la forma derivada del genoma microbiano o la forma derivada del ácido nucleico microbiano contienen un ácido nucleico que es específico para un microorganismo que tiene el genoma microbiano o el ácido nucleico microbiano, y

detectar el ácido nucleico específico microbiano, en donde la detección del ácido nucleico específico microbiano es indicativa de la presencia de un microorganismo que tiene el genoma microbiano o el ácido nucleico microbiano.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los uracilos en la forma derivada del genoma microbiano o la forma derivada del ácido nucleico microbiano son remplazados por timinas mediante la amplificación del genoma microbiano derivado o del ácido nucleico microbiano derivado para formar un genoma microbiano simplificado o un ácido nucleico microbiano simplificado que contiene un ácido nucleico que es específico para un microorganismo que tiene el genoma microbiano o el ácido nucleico microbiano.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende convertir el ARN microbiano en ADN antes de llevar a cabo el método.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende llevar a cabo el método sobre ARN microbiano para producir una molécula de ARN derivada o simplificada convirtiendo a continuación el ARN derivado o simplificado para formar una molécula de ADN derivada o simplificada.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el agente es bisulfito de sodio.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ácido nucleico específico microbiano comprende una o más secuencias de nucleótidos únicas para un microorganismo.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el ácido nucleico específico microbiano contiene sustancialmente solo bases seleccionadas entre adenina (A) , guanina (G) y timina (T) .

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el genoma microbiano o el ácido nucleico es de fago, virus, viroide, bacteria, hongo, alga, protozoo, espiroqueta, u organismo unicelular.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el ácido nucleico específico microbiano es de una región de un gen ribosomal de un procariota o de un microorganismo eucariótico unicelular.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la región del gen ribosomal es 16S o 23S en un procariota o 18S o 28S en un microorganismo eucariótico unicelular.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en donde la amplificación se lleva a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , amplificación isotérmica, o amplificación de la señal.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ácido nucleico específico microbiano se detecta mediante PCR en tiempo real.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ácido nucleico específico microbiano es detectado por un sistema de detección de micromatrices.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ácido nucleico específico microbiano es detectado:

proporcionando un ligando detector capaz de unirse a una región diana de la molécula de ácido nucleico específica microbiana y dejando tiempo suficiente para que el ligando detector se una a la región diana; y

midiendo la unión del ligando detector a la región diana para detectar la presencia del ácido nucleico específico microbiano.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el ácido nucleico específico microbiano es detectado mediante la separación de un producto de amplificación y la visualización del producto separado.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el producto de amplificación se separa mediante electroforesis y se detecta mediante la visualización de una o más bandas en un gel.

17. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el ácido nucleico específico microbiano no está presente naturalmente en el microorganismo.

18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la molécula de ácido nucleico específico microbiano tiene una secuencia de ácido nucleico indicativa de un nivel taxonómico del microorganismo.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el nivel taxonómico del microorganismo incluye familia, género, especie, cepa, tipo, o diferentes poblaciones de las mismas o diferentes poblaciones geográficas o bentónicas.

20. Un método para detectar la presencia de un microorganismo, comprendiendo el método:

tratar ácido nucleico microbiano con un agente seleccionado entre bisulfito, acetato o citrato que modifica la citosina a uracilo para formar un ácido nucleico microbiano derivado en el que las posiciones ocupadas naturalmente por citosinas en el ácido nucleico microbiano están ocupadas por uracilos en el ácido nucleico microbiano derivado;

proporcionar cebadores capaces de permitir la amplificación de una molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada específica de un microorganismo para el ácido nucleico microbiano derivado;

llevar a cabo una reacción de amplificación sobre el ácido nucleico microbiano derivado para formar un ácido nucleico simplificado que tenga timinas en lugar de uracilos en el ácido nucleico microbiano derivado; y

analizar la presencia de un producto de ácido nucleico amplificado que contiene la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada, en donde la detección del ácido nucleico específico microbiano deseado es indicativa de la presencia del microorganismo.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el microorganismo se selecciona entre fago, virus, viroide, bacteria, hongo, alga, protozoo, espiroqueta, u organismo unicelular.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 20 o 21, en donde el agente es bisulfito de sodio.

23. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde la amplificación se lleva a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , amplificación isotérmica, o amplificación de la señal.

24. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada se detecta mediante PCR en Tiempo Real.

25. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada se detecta mediante un sistema de detección de micromatrices.

26. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada es detectada:

proporcionando un ligando detector capaz de unirse a una región de la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada y dejando tiempo suficiente para que el ligando detector se una a la región; y

midiendo la unión del ligando detector a la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada para detectar la presencia de la molécula de ácido nucleico.

27. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada se detecta separando un producto de amplificación y visualizando el producto separado.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el producto de amplificación se separa mediante electroforesis y se detecta visualizando una o más bandas sobre un gel.