Métodos para seleccionar células eucarióticas que expresan una proteína heteróloga.

Un método para seleccionar cuando menos una célula huésped eucariótica que exprese un producto de interés,

el cual comprende cuando menos los siguientes pasos:

(a) proporcionar una pluralidad de células huésped eucarióticas transfectadas, en donde laviabilidad celular de las células huésped depende de la absorción de folato, en donde estas célulashuésped eucarióticas comprenden cuando menos:

(i) un polinucleótido introducido que codifica un producto de interés, y

(ii) un polinucleótido introducido que codifica una enzima de reductasa de dihidrofolato(DHFR);

(b) cultivar la pluralidad de células huésped eucarióticas en un medio de cultivo selectivo, el cualcomprende cuando menos un inhibidor de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) y folato en unaconcentración limitante;

(c) seleccionar cuando menos una célula huésped eucariótica que exprese el producto de interés.

Métodos para seleccionar células eucarióticas que expresan una proteína heteróloga Campo de la invención La presente invención se refiere a un método novedoso para seleccionar células huésped eucarióticas, en particular células huésped de mamífero, que expresan un producto de interés. Adicionalmente, la presente invención se refiere a un método para producir de una manera eficiente un producto de interés con un alto rendimiento.

Antecedentes de la invención La capacidad para clonar y expresar productos de interés, tales como péptidos y proteínas recombinantes en grandes cantidades, ha llegado a ser cada vez más importante. La capacidad para purificar altos niveles de proteínas es importante en el campo farmacéutico y biotecnológico humano, por ejemplo, para producir productos farmacéuticos de proteínas, así como en el establecimiento de la investigación básica, por ejemplo, para cristalizar proteínas con el fin de permitir la determinación de su estructura tridimensional. Las proteínas que sean de otra manera difíciles de obtener en cantidad, se pueden sobre-expresar en una célula huésped, y subsiguientemente se aíslan y se purifican.

La selección de un sistema de expresión para la producción de proteínas recombinantes depende de muchos factores, incluyendo las características del crecimiento celular, los niveles de expresión, la expresión intracelular y extracelular, las modificaciones posteriores a la traducción y la actividad biológica de la proteína de interés, así como las cuestiones regulatorias y las consideraciones económicas en la producción de proteínas terapéuticas. Las ventajas clave de las células de mamífero sobre otros sistemas de expresión, tales como bacterias o levadura, son la capacidad para llevar a cabo el plegamiento apropiado de la proteína, la compleja glicosilación N-enlazada, y una auténtica glicosilación O-enlazada, así como un amplio espectro de otras modificaciones posteriores a la traducción. Debido a las ventajas descritas, las células eucarióticas, y en particular las células de mamífero son actualmente el sistema de expresión de elección para producir proteínas terapéuticas complejas tales como anticuerpos monoclonales.

El planteamiento más común para obtener células huésped de alta expresión (también denominadas como altas productoras) genera un vector de expresión apropiado para expresar el producto de interés como un primer paso. El vector de expresión impulsa la expresión del polinucleótido que codifica el producto de interés en la célula huésped, y proporciona cuando menos un marcador seleccionable para generar la línea celular recombinante. Los elementos clave de los vectores de expresión de mamífero usualmente incluyen un promotor constitutivo o inducible capaz de tener una actividad de transcripción robusta; un procesamiento de ARNm optimizado, y señales de traducción que usualmente incluyen una secuencia Kozak, un codón de terminación de traducción, señales de poliadenilación y disociación del ARNm, un terminador de transcripción y marcadores seleccionables para la preparación de líneas celulares estables y para la amplificación genética; adicionalmente se pueden proporcionar un origen de replicación procariótico y marcadores seleccionables para la propagación del vector en bacterias mediante el vector de expresión.

En los años recientes, el enfoque del desarrollo se ha estado concentrando en el diseño de vectores mejorados para la expresión genética en las células huésped. A pesar de la gran cantidad de vectores disponibles, sin embargo, todavía es desafiante una producción robusta de polipéptidos/proteínas con un alto rendimiento en las células de mamífero.

Un procedimiento establecido para obtener líneas celulares de alta producción que expresen el producto de interés con un alto rendimiento es la transfección estable de las células huésped. Sin embargo, la integración estable en el genoma es un suceso raro, y solamente un pequeño subconjunto de células establemente transfectadas son altas productoras. De conformidad con lo anterior, esta selección es desafiante.

Los marcadores seleccionables y los sistemas de selección se utilizan ampliamente en la ingeniería genética, en la tecnología de ADN recombinante, y en la producción de productos recombinantes con el objeto de obtener células huésped que expresen el producto de interés con un alto rendimiento. Los sistemas respectivos son también útiles para generar e identificar los clones establemente transfectados. La meta primaria de la utilización de los marcadores seleccionables respectivos y los sistemas de selección es introducir un gen seleccionable que, después de su exposición a condiciones de crecimiento selectivas, permita hacer la identificación de las células capaces de tener un alto nivel de producción del marcador seleccionable introducido, y de acuerdo con lo mismo, del producto recombinante de interés. El aumento del rendimiento de la expresión del producto se puede lograr, por ejemplo, mediante amplificación genética utilizando líneas celulares, por ejemplo, deficientes en una enzima, tal como reductasa de dihidrofolato (DHFR) o sintetasa de glutamina (GS) en conjunto con vectores de expresión que contengan genes que codifiquen estas enzimas marcadoras seleccionables, y agentes tales como metotrexato (MTX) , que inhibe la reductasa de dihidrofolato (DHFR) , y la metionina-sulfoxamina (MSX) que inhibe la sintetasa de glutamina (GS) .

La Patente Europea Número EP 0 246 049 describe un método para obtener un transformante de célula animal, en el que el transformante se obtiene introduciendo en una célula de animal de tipo silvestre un gen de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) de tipo silvestre y un gen estructural que codifica una proteína de interés. Se cultivan las células en un medio de cultivo selectivo que comprende metotrexato (MTX) .

Zhou y colaboradores, (2006 Biotechnology Progress 22, 313-318) describen un sistema de selección de reductasa de dihidrofolato (DHFR) en el que se co-transfectaron células CHO usando plásmidos, uno que contiene los genes de reductasa de dihidrofolasa y cadena pesada de IgG y el otro que contiene los genes de fosfotransferasa de neomicina (neo) y cadena ligera de IgG. Se cultivan las células mediante aumentos por etapas en la concentración de metotrexato (MTX) y se notifican las tasas de (inv.) .

Mayer-Kuckuk y colaboradores (PNAS, 19 de marzo de 2002, vol. 99 n.º 6; 3400-3405) describen que las células humanas enfrentadas a antifolatos muestran un rápido aumento en los niveles de la enzima reductasa de dihidrofolato.

Zhu y colaboradores (Journal of Experimental Therapeutics and Oncology, 2:264-277, 2002) muestran que las restricciones graves de folato dan como resultado el agotamiento de y la alteración en la composición de la reserva de folato intracelular, sensibilización moderada al metotrexato y trimetrexato y una regulación por incremento de la actividad de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) endógena.

Santos y colaboradores (Bioorganic and Medicinal Chemistr y 15 (2007) 1266-1274) describen una serie de nuevos derivados de hidroxamato basados en aminopteroílo que seleccionan como diana dos familias de enzimas, concretamente metaloproteinasas de la matriz y reductasa de dihidrofolato (DHFR) . Se sometieron a prueba sus efectos en modelos de cultivo celular in vitro.

Etienne y colaboradores (Biochemical Pharmacology, vol. 46, n.º 10, págs. 1767-1774, 1993) analizan el efecto in vitro de diferentes concentraciones de folatos reducidos con MTX sobre diferentes tipos celulares de cáncer.

Backus y colaboradores (Int. J. Cancer: 87, 771-778 (2000) ) analizan el efecto del agotamiento de folato sobre la sensibilidad de líneas celulares de tumores sólidos con respecto a diferentes inhibidores de sintasa de timidilato (TS)

o reductasa de dihidrofolato (DHFR) .

Un sistema de selección prominente que se utiliza comúnmente en la técnica anterior, es el sistema de selección de reductasa de dihidrofolato (DHFR) /MTX. La reductasa de dihidrofolato (DHFR) cataliza la reducción dependiente de NADP del ácido dihidrofólico hasta ácido tetrahidrofólico (THF) . El tetrahidrofolato (THF) se intraconvierte entonces hasta 10-formil-DHF y 5, 10-metilen-DHF que se utilizan en la biosíntesis de novo de purinas y timidilato, respectivamente. DHF es el subproducto de la actividad catalítica de la sintasa de timidilato (TS) , la cual cataliza la conversión de dUMP hasta dTMP en una reacción dependiente de 5, 10-metilen-THF. Por consiguiente, la reductasa de dihidrofolato (DHFR) es crucial para el reciclaje de los co-factores de tetrahidrofolato (THF) que son esenciales para la biosíntesis... [Seguir leyendo]

1. Un método para seleccionar cuando menos una célula huésped eucariótica que exprese un producto de interés, el cual comprende cuando menos los siguientes pasos:

(a) proporcionar una pluralidad de células huésped eucarióticas transfectadas, en donde la viabilidad celular de las células huésped depende de la absorción de folato, en donde estas células huésped eucarióticas comprenden cuando menos:

(i) un polinucleótido introducido que codifica un producto de interés, y

(ii) un polinucleótido introducido que codifica una enzima de reductasa de dihidrofolato (DHFR) ;

(b) cultivar la pluralidad de células huésped eucarióticas en un medio de cultivo selectivo, el cual comprende cuando menos un inhibidor de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) y folato en una concentración limitante;

(c) seleccionar cuando menos una célula huésped eucariótica que exprese el producto de interés.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el medio de cultivo selectivo comprende el inhibidor de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) en una concentración de 500 nM o menos, y un folato en una concentración de 500 nM o menos.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el medio de cultivo selectivo comprende el inhibidor de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) en una concentración de 200 nM o menos, y/o comprende un folato en una concentración de 2, 5 nM a 100 nM.

4. El método de acuerdo con cuando menos una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el medio de cultivo selectivo comprende ácido fólico como folato en una concentración de 12, 5 nM a 50 nM, combinado con MTX como inhibidor de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) en una concentración de 10 nM a 100 nM.

5. El método de acuerdo con cuando menos una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la enzima de reductasa de dihidrofolato (DHFR) es una enzima de reductasa de dihidrofolato (DHFR) que tiene una sensibilidad más baja a un inhibidor de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) que la enzima de reductasa de dihidrofolato (DHFR) endógenamente expresada por la célula huésped.

6. El método de acuerdo con cuando menos una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la célula huésped eucariota mencionada es una célula huésped CHO, de preferencia una célula DHFR+ (positiva) .

7. El método de acuerdo con cuando menos una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde se utiliza una célula

huésped DHFR+ (positiva) , en conjunto con una enzima de reductasa de dihidrofolato (DHFR) introducida que es menos sensible al MTX que la enzima de reductasa de dihidrofolato (DHFR) endógenamente expresada por la célula huésped.

8. El método de acuerdo con cuando menos una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polinucleótido que codifica un producto de interés y el polinucleótido que codifica una enzima de reductasa de dihidrofolato (DHFR) se 35 han introducido mediante cuando menos un vector de expresión.

9. El método de acuerdo con cuando menos una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la célula huésped comprende cuando menos dos polinucleótidos introducidos que codifican un producto de interés, en donde de preferencia cuando menos un polinucleótido codifica la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina, y el otro polinucleótido codifica la cadena ligera de una molécula de inmunoglobulina.

10. El método de acuerdo con cuando menos una de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el/los polinucleótido (s) introducido (s) que codifica (n) el producto de interés, y el polinucleótido introducido que codifica la enzima de reductasa de dihidrofolato (DHFR) , están comprendidos en casetes de expresión diferentes, y en donde el/los casete (s) de expresión para impulsar la expresión del/de los polinucleótido (s) que codifica (n) el producto de interés comprende (n) un promotor y/o potenciador más fuerte que el casete de expresión para impulsar la expresión del

polinucleótido que codifica la enzima de reductasa de dihidrofolato (DHFR) .

11. Un método para producir un producto de interés, el cual comprende cuando menos los siguientes pasos:

(a) llevar a cabo el método de selección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para seleccionar cuando menos una célula huésped eucariótica que exprese el producto de interés; y

(b) cultivar cuando menos una célula huésped eucariótica seleccionada bajo condiciones que permitan la expresión del producto de interés.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, el cual comprende cuando menos uno de los siguientes pasos:

(c) aislar el producto de interés a partir de dicho medio de cultivo celular y/o a partir de dicha célula huésped eucariótica; y/o

(d) procesar adicionalmente el producto de interés aislado.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en donde el producto de interés es una molécula de 10 inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma.

14. Uso de un medio de cultivo selectivo, el cual comprende un inhibidor de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) en una concentración de 500 nM o menos y un folato en una concentración limitante de 500 nM o menos en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el medio de cultivo selectivo tiene una o más de las 15 siguientes características

(a) el medio de cultivo selectivo comprende folato en una concentración limitante de 2, 5 nM a 100 nM, y/o el inhibidor de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) en una concentración de 200 nM o menos; y/o (b) el medio de cultivo selectivo comprende ácido fólico en una concentración de 12, 5 nM a 50 nM, 20 combinado con una concentración de MTX de 10 nM a 100 nM.