Métodos para preparar andamio poroso para la ingeniería de tejidos.

Un método para preparar un andamio poroso, que comprende las etapas que consisten en:

a) preparar una disolución acuosa alcalina que comprende una cantidad de al menos un polisacárido y un agentereticulante;

b) congelar la disolución acuosa de la etapa a);

c) sublimar la disolución congelada de la etapa b);

que se caracteriza porque la reticulación del polisacárido se produce durante la etapa de sublimación c).

Métodos para preparar andamio poroso para la ingeniería de tejidos.

Campo de la invención.

La presente invención se refiere a un método para preparar un andamio (“scaffold”) poroso para la ingeniería de tejidos. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un andamio poroso que puede obtenerse mediante el método descrito anteriormente, y su uso para la ingeniería de tjidos, el cultivo celular y el transporte celular.

Antecedentes de la invención.

La ingeniería de tejidos en general se define como la creación de equivalentes de tejidos u órganos sembrando células sobre o en el interior de un andamio adecuado para la implantación. Los andamios deben ser biocompatibles, y las células deben poder fijarse y proliferar sobre los andamios para que formen equivalentes de tejidos u órganos. Por tanto, puede considerarse que estos andamios son sustratos para el crecimiento celular in vitro o in vivo.

Los atributos de un andamio biocompatible ideal incluirían la capacidad para mantener el crecimiento celular in vitro o in vivo, la capacidad de mantener el crecimiento de una amplia variedad de tipos o linajes celulares, la capacidad de estar dotado de diferentes grados de flexibilidad o de rigidez necesarios, la capacidad de tener diversos grados de biodegradabilidad, la capacidad de ser introducido en el sitio previsto in vivo sin provocar daños secundarios, y la capacidad para actuar como vehículo o depósito para el transporte de fármacos, células y/o sustancias bioactivas hasta el sitio de acción deseado.

Se ha utilizado una serie de diferentes materiales de andamio para la regeneración de tejidos guiada y/o como superficies biocompatibles. En muchos casos se prefieren materiales poliméricos biodegradables, puesto que el andamio se degrada a lo largo del tiempo y, finalmente, la estructura de células-andamio es sustituida por completo por células. Entre los muchos candidatos que pueden actuar como andamios útiles que pueden mantener el crecimiento o la regeneración de tejidos se incluyen geles, espumas, láminas, y numerosas estructuras en partículas porosas de distantas formas y configuraciones.

Entre los diversos polímeros naturales que se han descrito como útiles para el cultivo o la ingeniería de tejidos, se pueden enumerar diversos constituyentes de la matriz extracelular, incluyendo fibronectina, diversos tipos de colágeno, y laminina, así como queratina, fibrina y fibrinógeno, ácido hialurónico, sulfato de heparina, sulfato de condroitina y otros.

Otros polímeros habituales que se han utilizado incluyen la poli (lactida-co-glicólido) (PLG) . Las PLG son polímeros hidrolíticamente degradables que están aprobados por la FDA para su uso en el cuerpo humano y son fuertes desde el punto de vista mecánico (Thomson, R.C., Yaszemski, M.J., Powers, J.M., Mikos, A.G., Fabrication of biodegradable polymer scaffolds to engineer trabecular bone, J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 1995, 7 (1) :23-38; Wong, W.H., Mooney, D.J., Synthesis and properties of biodegradable polymers used as synthetic matrices for tissue engineering, en: Atala, A., Mooney, D.J., editores, Langer, R., Vacanti, J.P., editores asociados, Synthetic biodegradable polymer scaffolds, Boston, Birkhäuser, 1997, pp. 51-82) . Sin embargo son hidrófobos y generalmente se procesan bajo condiciones relativamente rigurosas, que hace que el factor de incorporación y atrapamiento de las células viables sea potencialmente un reto.

Como alternativa, se ha empleado una diversidad de hidrogeles, una clase de materiales poliméricos muy hidratados (con un contenido en agua mayor que 30% en peso) , como materiales de andamio. Están compuestos de cadenas poliméricas hidrófilas, que son de origen natural o sintético. La integridad estructural de los hidrogeles depende de la reticulación formada entre las cadenas poliméricas a través de diversos enlaces químicos e interacciones físicas. Los hidrogeles utilizados en estas aplicaciones son generalmente degradables, pueden procesarse bajo condiciones relativamente suaves, tienen propiedades mecánicas y estructurales similares a muchos tejidos y a la matriz extracelular, y pueden introducirse de una manera mínimamente invasiva (Lee, K.Y., Mooney, D.J., Hydrogels for tissue engineering, Chem. Rev., julio de 2001, 101 (7) :1869-1879) . Por tanto, se han utilizado diversos polímeros para procesar hidrogeles. Por ejemplo, estos polímeros incluyen colágeno, gelatina, ácido hialurónico (HA) , y quitosano.

El uso de polisacáridos naturales también representa una alternativa prometedora para fabricar andamios basados en hidrogeles, porque no son antigénicos ni inmunogénicos, y algunos presentan efectos antitrombóticos e interacciones con factores del crecimiento vascular. Además, debido a sus propiedades de plasticidad, los hidrogeles basados en polisacáridos pueden conformarse en diversas formas para permitir el diseño de materiales de injerto o implante terapéuticos.

Por ejemplo, Chaouat et al. (Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D., The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats, Biomaterials, noviembre de 2006, 27 (32) :5546-5553, Epub, 20 de julio de 2006) han diseñado un nuevo andamio basado en polisacáridos preparado utilizando una mezcla de pululano y dextrano. La reticulación química de los polisacáridos se realizó utilizando el agente reticulante trimetafosfato de trisodio (STMP) . Después, se demostró in vivo la eficacia de un material arterial preparado con este andamio.

Sin embargo, a pesar de la ventaja de utilizar polisacáridos para preparar andamios según se describen en Chaouat et al. (2006) , la falta de porosidad del andamio resultante sigue siendo un inconveniente para considerar un uso eficaz para fines terapéuticos. En realidad, la porosidad es una característica fundamental para permitir la proliferación, la integración y la diferenciación de las células dentro del andamio, de modo que el material puede utilizarse como depósito de células para reconstruir in vivo el tejido u órgano.

El documento US 2004/0063206 describe un método para fabricar andamios programables para el cultivo de células con combinaciones de moléculas que estimulan la fijación celular o que tienen funciones de señalización celular. El andamio tridimensional se obtiene con estructuras de poros interconectados; estas estructuras porosas surgen a partir de cristales de hielo formados durante la congelación, y cuando las cristales se liofilizan, el espacio que dejan los cristales de hielo forman estructuras de poros interconectados.

El documento US 2002/0187182 describe materiales poliméricos reticulables, que normalmente se utilizan para formar geles, que pueden emplearse para formar materiales macroporosos que tienen propiedades de gel y macroporosidad. Los geles se forman disolviendo un polímero reticulable en agua (sin reticularlo) ; congelando la disolución acuosa; liofilizando la disolución para formar una lana porosa seca; y reticulando los polímeros en el estado de lana. La lana es útil como dispositivo de transporte de fármacos, y para regenerar y reconstruir tejidos, tales como cartílago, tendón, menisco y ligamentos.

El documento WO 2007/056418 describe andamios con una forma muy porosa, obtenidos liofilizando y sublimando el material.

Por tanto, en la técnica es necesario desarrollar un método para preparar matrices de andamios porosos que puedan utilizarse para fines terapéuticos.

Sumario de la invención.

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para preparar un andamio poroso, que comprende las etapas que consisten en:

a) preparar una disolución acuosa alcalina que comprende una cantidad de al menos un polisacárido y un agente reticulante;

b) congelar la disolución acuosa de la etapa a) ;

c) sublimar la disolución congelada de la etapa b) ;

que se caracteriza porque la etapa b) se realiza antes de que se produzca la reticulación del polisacárido en la disolución de la etapa a) .

Según la invención, la expresión “la etapa b) se realiza antes de que se produzca la reticulación del polisacárido en la disolución de la etapa a) ” significa que la reticulación del polisacárido se produce durante la etapa de sublimación (etapa c) ) .

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un andamio poroso obtenible mediante el método descrito anteriormente.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar el uso de un andamio poroso de la invención para la ingeniería de tejidos.

Descripción detallada de la invención.

Definiciones.

El término “polisacárido”,... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar un andamio poroso, que comprende las etapas que consisten en:

a) preparar una disolución acuosa alcalina que comprende una cantidad de al menos un polisacárido y un agente reticulante; b) congelar la disolución acuosa de la etapa a) ; c) sublimar la disolución congelada de la etapa b) ; que se caracteriza porque la reticulación del polisacárido se produce durante la etapa de sublimación c) . 2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido se selecciona del grupo que consiste en dextrano,

agar, ácido algínico, ácido hialurónico, inulina, pululano, heparina, quitosano, y fucoidano. 3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho agente reticulante se selecciona del grupo que consiste

en trimetafosfato de trisodio (STMP) , oxicloruro de fósforo (POCl3) , epiclorohidrina, formaldehídos, carbodiimidas hidrosolubles, y glutaraldehídos. 4. El método según la reivindicación 3, en el que dicho agente reticulante es trimetafosfato de sodio (STMP) . 5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la disolución acuosa de la etapa a) se

liofiliza.

6. El método según la reivindicación 5, en el que la disolución acuosa de la etapa a) se liofiliza bajo una presión de 10 Pa (0, 1 mBar) a 650 Pa (6, 5 mBar) . 7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende otra etapa que consiste en

rehidratar el andamio obtenido en la etapa c) . 8. Un andamio poroso que puede obtenerse mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7. 9. El andamio poroso de la reivindicación 8, en el que el tamaño de los poros es de entre 1 !m y 500 !m. 10. El andamio poroso según la reivindicación 8 o 9, en el que la porosidad es de entre 4% y 50%. 11. El andamio poroso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que se caracteriza porque está cargado

con una cantidad de células, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en células de levadura, células

de mamífero, células de insecto, y células vegetales. 12. El andamio poroso según la reivindicación 11, en el que las células son células de mamífero seleccionadas del grupo que consiste en condrocitos; fibrocondrocitos; osteocitos; osteoblastos; osteoclastos; células musculares; sinoviocitos; células de la médula ósea; células mesenquimáticas; células epiteliales; hepatocitos; células estromáticas; células precursoras; células precursoras embrionarias; células precursoras derivadas de tejido adiposo; células progenitoras de sangre periférica; células precursoras aisladas de tejido adulto; y células genéticamente transformadas.

13. El andamio poroso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 para la ingeniería de tejidos, el cultivo

celular tridimensional, o el transporte de células para un uso terapéutico. 14. Un sustituto vascular fabricado con un andamio según se define según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

15. Implantes de cartílago o de hueso fabricados con un andamio según se define según una cualquiera de las

reivindicaciones 8 a 11. 16. El uso de un andamio según se define según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para la evaluación de la toxicidad y/o la farmacología de un producto.

17. Un sistema de liberación controlada de un agente activo fabricado con un andamio según se define según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.