Métodos para la formación de enlaces disulfuro.

Un método para formar un enlace disulfuro entre un primer residuo cisteína comprendido en un primer(poli)péptido/proteína y un segundo residuo cisteína comprendido en un segundo (poli)péptido/proteína,

comprendiendo el método:

(a) introducir artificialmente un aminoácido con un pI mayor que 8 en dicho primer (poli)péptido/proteína osegundo (poli)péptido/proteína,

en donde dicho aminoácido afecta positivamente a la reactividad de al menos uno de dichos residuoscisteína,

y

(b) causar o permitir la fijación de dicho primer (poli)péptido/proteína a dicho segundo (poli)péptido/proteína,en donde dicha fijación está causada por la formación de un enlace disulfuro entre el primer residuo cisteína yel segundo residuo cisteína,

en donde dicho primer (poli)péptido/proteína es un miembro de la cubierta proteica de una partícula debacteriófago,

y en donde dicho segundo (poli)péptido/proteína comprende una inmunoglobulina o un fragmento funcionalde la misma.

Métodos para la formación de enlaces disulfuro Antecedentes de la Invención En 1985, Smith demostró por primera vez que los fagos filamentosos toleran fragmentos de proteína extraños insertados en su proteína del gen III (pIII) , y pudo demostrar que los fragmentos de proteína se presentan en la superficie del fago (Smith, 1985) . Ladner extendió este concepto al cribado de repertorios de (poli) péptidos y/o proteínas presentados en la superficie de partículas de fago (WO 88/06630; WO 90/02809) . Desde entonces, la presentación de fago ha experimentado un progreso espectacular y ha dado como resultado logros sustanciales.

Se han desarrollado diversos formatos para construir y cribar bibliotecas de presentación de fago (poli) péptido/proteína, y un gran número de artículos de revista y monografías abarcan y resumen estos avances (v.g., Kay et al., 1996; Dunn, 1996; McGregor, 1996) . En la mayor parte de los casos, se han utilizado sistemas basados en fagos filamentosos.

Propuesto inicialmente como presentación de fragmentos monocatenarios Fv (scFv) (WO 88/06630; véase también WO 92/01047) , el método se ha expandido rápidamente a la presentación de otros (poli) péptidos/proteínas, tales como el inhibidor de la tripsina pancreática bovina (BPTI) (WO 90/02809) , bibliotecas de péptidos (WO 91/19818) , hormona del crecimiento humano (WO 92/09690) , y diversas otras proteínas, con inclusión de la presentación de proteínas multímeras tales como fragmentos Fab (WO 91/17271; WO 92/01047) .

Para anclar los (poli) péptidos/proteínas a la superficie del bacteriófago filamentoso, se emplean en la mayoría de los casos fusiones genéticas a las proteínas de la cubierta del fago. Se prefieren fusiones a la proteína del gen III (Parmley & Smith, 1988) o fragmentos de la misma (Bass et al., 1990) , y la proteína del gen VIII (Greenwood et al., 1991) . En un caso, se ha utilizado en gen VI (Jespers et al., 01995) , y en un caso, se ha utilizado una combinación de gen VII y gen IX para la presentación de fragmentos Fv (Gao et al., 1999) .

Adicionalmente, se ha logrado también la presentación de fago en fago lambda. En este caso, se han utilizado la proteína del gen V (Maruyama et al., 1994) , la proteína del gen J, y la proteína del gen D (Sternberg & Hoess, 1995; Mikawa et al., 1996) .

Además de la utilización de fusiones genéticas, se han unido péptidos o proteínas extraños a superficies de fago por la vía de dominios de asociación. En WO 91/17271, se sugirió utilizar un identificador presentado en fago y un ligando de fijación de identificador fusionado al (poli) péptido/proteína a presentar para conseguir una presentación no covalente.

Un concepto similar fue aplicado para la presentación de bibliotecas de cDNA (Crameri & Suter, 1993) . En este caso se utilizó la interacción jun/fos para mediar la presentación de fragmentos de cDNA. En su constructo, residuos cisteína adicionales flanqueantes de ambos extremos de jun y de fos estabilizaban adicionalmente la interacción por formación de dos enlaces disulfuro.

Un problema era habitualmente el modo de recuperar mejor los fagos que se han unido a la diana deseada. Normalmente, esto se consigue por elución con tampones apropiados, sea por utilización de un gradiente de pH o de sal, o por elución específica utilizando una diana soluble. Sin embargo, los ligantes más interesantes que se fijan con afinidad alta a la diana podrían perderse por dicho enfoque. Se han descrito varios métodos alternativos que intentan resolver dicho problema, sea proporcionando una señal de escisión entre el (poli) péptido/proteína a presentar y su pareja de fusión, o entre la diana de interés y su portador que ancla la diana a una superficie sólida. Adicionalmente, la mayoría de los enfoques a que se ha hecho referencia anteriormente en esta memoria requieren el uso de proteínas de fusión que comprenden al menos parte de una proteína de la cubierta del fago y un (poli) péptido/proteína extraño.

En WO 01/05950, se describe un sistema totalmente diferente que no requiere proteínas de fusión, y por tanto resuelve muchos de estos problemas. El denominado sistema "CysDisplay", descrito en WO 01/05950, está basado en la formación de un enlace disulfuro covalente entre una proteína de la cubierta del bacteriófago y una inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma. La inmunoglobulina, o el fragmento funcional de la misma, se presenta en la superficie de una partícula de bacteriófago. Una tecnología similar se dio a conocer posteriormente en WO 03/060065. WO 03/060065 difiere de WO 01/05950 en que el polipéptido pIII marcado con Cys se proporciona por un fago adyuvante modificado en lugar de un fagémido. Adicionalmente, WO 03/060065 menciona también otros adaptadores que podrían emplearse para presentar (poli) péptidos/proteínas en partículas de bacteriófago, tales como proteínas homomultímeras (PDGF, Max, ReIA, neurotrofina) y proteínas heteromultímeras (complejos proteína-quinasa, proteínas “conating” el dominio SH2, a-Pal/Max, Hox/Pbx) .

Aunque el sistema "CysDisplay" funciona satisfactoriamente, un sistema que exhiba cantidades mayores de los (poli) péptidos/proteínas en las partículas de bacteriófago puede ser ventajoso en ciertas situaciones; por ejemplo, como un sistema mejorado de este tipo con tasas de presentación incrementadas, en particular una tasa de presentación funcional incrementada sería sin duda beneficioso y haría posible el aislamiento más conveniente, fiable y específico de ligantes, en particular ligantes que se fijen a su diana con afinidad alta.

Adicionalmente, Paschke et al., 2006, dieron a conocer el uso de jun/fos en un sistema de presentación de fago. Una proteína de interés y la proteína del fago pIII se fusionaban a jun o fos respectivamente. De este modo, una interacción por la vía de residuos cisteína que están presentes inherentemente en ambos, jun y fos, mediaba la interacción de la proteína de interés y la proteína del fago pIII.

Sny der et al., 1981, investigaron el entorno local de residuos cisteína reactivos de péptidos de proteínas existentes naturalmente por tratamiento con ácido 2-nitrobenzoico y observaron que los residuos cisteína rodeados por aminoácidos cargados positivamente exhibían mayor reactividad. En un estudio de continuación, Sny der et al., 1983, investigaron la cinética de la formación de disulfuro y llegaron esencialmente a las mismas conclusiones. Bulaj et al., 1998, investigaron la cinética de 16 péptidos modelo en cuanto a su capacidad para formar enlaces disulfuro con diversas moléculas no proteináceas. Observaron que la presencia de cargas netas en los péptidos y en los reactivos no proteináceos tiene influencia en la reactividad. Britto et al., 2002, investigaron el entorno electrostático de enlaces disulfuro intramoleculares en tubulina y encontraron que los residuos cisteína más reactivos estaban dentro de 6, 5 Angstrom de residuos con carga positiva, promoviendo presumiblemente la disociación del tiol al anión tiolato.

Singh R.R. et al., 2002, caracterizaron inhibidores de proteasas ricas en disulfuro e identificaron residuos lisina y arginina en la proximidad de un residuo cisteína que contribuyen probablemente a la reactividad de los enlaces disulfuro respectivos. Ya en 1991, Yang et al. identificaron aminoácidos funcionales dentro del centro activo de una proteína enzimática por mutagénesis orientada, y encontraron que el reemplazamiento de Arg26 o Lys27 en glutarredoxina de porcino reducía la reactividad de Cys22 del centro activo.

Hansen et al., 2005, investigaron enlaces disulfuro intramoleculares de YFP producida por ingeniería genética y encontraron un aumento en la reactividad si están presentes aminoácidos con carga positiva en la proximidad de los residuos cisteína reactivos. Albrecht et al., 2006, informaron de la generación de Fab's monoespecíficos multivalentes unidos a PEG por residuos cisteína.

Sin embargo, ninguno de los estudios anteriores describe un sistema en el cual se forma un enlace disulfuro intermolecular entre un primer (poli) péptido/proteína y un segundo (poli) péptido/proteína diferente. En particular, en ninguno de estos estudios se forma un enlace disulfuro de este tipo en el espacio periplasmático de una célula hospedadora. Adicionalmente, en ninguno de los estudios citados se presenta un (poli) péptido/proteína en la superficie de una partícula de bacteriófago.

Sumario de la Invención Así pues, la presente invención proporciona un método para formar un enlace disulfuro entre un primer residuo cisteína comprendido en un primer (poli) péptido/proteína y un segundo residuo cisteína... [Seguir leyendo]

1. Un método para formar un enlace disulfuro entre un primer residuo cisteína comprendido en un primer (poli) péptido/proteína y un segundo residuo cisteína comprendido en un segundo (poli) péptido/proteína, comprendiendo el método:

(a) introducir artificialmente un aminoácido con un pI mayor que 8 en dicho primer (poli) péptido/proteína o segundo (poli) péptido/proteína, en donde dicho aminoácido afecta positivamente a la reactividad de al menos uno de dichos residuos cisteína, y

(b) causar o permitir la fijación de dicho primer (poli) péptido/proteína a dicho segundo (poli) péptido/proteína, en donde dicha fijación está causada por la formación de un enlace disulfuro entre el primer residuo cisteína y el segundo residuo cisteína, en donde dicho primer (poli) péptido/proteína es un miembro de la cubierta proteica de una partícula de bacteriófago, y en donde dicho segundo (poli) péptido/proteína comprende una inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho aminoácido con un pI mayor que 8 se introduce en dicho primer (poli) péptido/proteína.

3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho aminoácido con un pI mayor que 8 se introduce en dicho segundo (poli) péptido/proteína.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho segundo (poli) péptido/proteína se presenta en la superficie de una partícula de bacteriófago.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho enlace disulfuro se forma en el espacio periplasmático de una célula hospedadora.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho aminoácido con un pI mayor que 8 se selecciona de lisina y arginina.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho miembro de la cubierta proteica es

(i) una variante truncada de una proteína de la cubierta de un bacteriófago de tipo salvaje, en donde dicha variante truncada comprende al menos aquella parte de dicha proteína de la cubierta de tipo salvaje que causa la incorporación de dicha proteína de la cubierta en la cubierta proteica de una partícula de bacteriófago o

(ii) una variante modificada de una proteína de la cubierta de un bacteriófago de tipo salvaje, en donde dicha variante modificada es capaz de incorporarse en la cubierta proteica de la partícula de bacteriófago.

8. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante modificada de una proteína de la cubierta de un bacteriófago de tipo salvaje, en donde dicha variante modificada comprende:

(a) una o más partes de dicha proteína de la cubierta de un bacteriófago de tipo salvaje, en donde una de dichas partes comprende al menos aquella parte que causa o permite la incorporación de dicha proteína de la cubierta en la cubierta del fago,

(b) un residuo cisteína N-terminal o C-terminal, y

(c) un aminoácido con un pI mayor que 8, que está localizado dentro de 5 aminoácidos adyacente a y que afecta positivamente a la reactividad de dicho residuo cisteína N-terminal o C-terminal.

9. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina modificada o fragmento funcional de la misma, en donde dicha inmunoglobulina modificada o un fragmento funcional comprende:

(a) una inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma,

(b) un residuo cisteína N-terminal o C-terminal, y

(c) un aminoácido con un pI mayor que 8, que está localizado dentro de 5 aminoácidos adyacente a y que afecta positivamente a la reactividad de dicho residuo cisteína N-terminal o C-terminal.

10. Un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9.

11. Una célula hospedadora que comprende la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 o el vector de la reivindicación 10.

12. Una colección diversa de partículas de bacteriófago que puede obtenerse por el método de la reivindicación 4, en donde cada una de dichas partículas de bacteriófago presenta un segundo (poli) péptido/proteína de una colección diversa de segundos (poli) péptidos/proteínas.

13. Un complejo que comprende

(a) un primer (poli) péptido/proteína que comprende un primer residuo cisteína; y

(b) un segundo (poli) péptido/proteína que comprende un segundo residuo cisteína, en donde uno de dichos

(poli) péptidos/proteínas comprende adicionalmente un aminoácido con un pI mayor que 8, que está localizado dentro de cinco aminoácidos adyacentes a y que afecta positivamente a la reactividad de al menos uno de dichos residuos cisteína,

en donde dicho primer (poli) péptido/proteína es un miembro de la cubierta proteica de una partícula de bacteriófago, en donde dicho segundo (poli) péptido/proteína comprende una inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma, y en donde dicho primer y dicho segundo (poli) péptido/proteína forman un enlace disulfuro por la vía de dichos residuos cisteína.

14. El complejo de la reivindicación 13, en donde dicho segundo (poli) péptido/proteína es un miembro de una colección diversa de segundos (poli) péptidos/proteínas presentados en una colección diversa de una pluralidad de partículas de bacteriófago.

Figura 1: Un vector CysDisplay típico Figura 2: Fijación a placas Ni-NTA Figura 3: Tasas de presentación funcionales de pMORPH25 versiones A, B y C

Figura 7: Secuencia de un derivado de pMORPH25 que contiene un fragmento Fab HuCAL específico de Estrodiol-BSA