Métodos para la adaptación al ser humano de anticuerpos monoclonales.

Método de selección de armazones de anticuerpos humanos para su uso en la preparación de un anticuerpo adaptado al ser humano,

que comprende las etapas de:

a) obtener una secuencia peptídica para una región variable de un anticuerpo no humano;

b) delimitar las secuencias peptídicas de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las regiones estructurales de la región variable no humana;

c) construir una biblioteca de secuencias peptídicas para las regiones estructurales 1, 2, 3 y 4 del anticuerpo humano, codificadas por los genes de la línea germinal humana;

d) seleccionar un subconjunto de secuencias peptídicas humanas miembros de la biblioteca que tengan una longitud idéntica a la de las regiones estructurales del anticuerpo maduro no humano;

e) comparar la similitud de secuencia de las regiones estructurales de las secuencias peptídicas humanas seleccionadas con las secuencias peptídicas de las regiones estructurales no humanas;

f) comparar la compatibilidad de longitud de CDR1 y CDR2 entre las secuencias peptídicas humanas seleccionadas y las secuencias peptídicas de las regiones estructurales no humanas;

g) seleccionar un segundo subconjunto del subconjunto de secuencias peptídicas humanas seleccionadas de la etapa d); en la que las secuencias peptídicas seleccionados tienen una similitud de secuencia de las regiones estructurales superior a un valor "identity_threshold", y la suma de la diferencia de longitud de CDR1 y CDR2 es inferior o igual a un valor "CDR12_length_compatibility_threshold", en el que dicho valor "CDR12_length_compatibility_threshold" es 0 ó 1; y

h) seleccionar los armazones representativos del segundo subconjunto de la etapa g) en base a un valor "library_size" y un valor "framework_region_redundancy", en el que dicho valor "framework_region_redundancy" es de 1 a 3.

Métodos para la adaptación al ser humano de anticuerpos monoclonales.

Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos para seleccionar armazones de la región variable humana para la adaptación al ser humano de anticuerpos monoclonales no humanos, tales como anticuerpos de roedor.

Antecedentes de la invención La adaptación de anticuerpos al ser humano es un término genérico que describe la obtención por ingeniería genética de anticuerpos monoclonales (AcMo) xenogénicos contra dianas terapéuticas humanas para reemplazar al máximo las secuencias xenogénicas con secuencias de anticuerpos humanos preservando al mismo tiempo sus especificidades de unión al antígeno. El objetivo es reducir la inmunogenicidad de estos anticuerpos para mejorar sus propiedades y valores terapéuticos. Los anticuerpos generados por ingeniería genética también son conocidos en la técnica como anticuerpos humanizados o con injerto de CDR.

El documento EE.UU. 2005/148001 da a conocer la construcción basada en la estructura de bibliotecas de anticuerpos humanos. Morea et al. (Biophysical Chemistr y , 1997, volumen 68, páginas 9-16) se refiere a la estructura, predicción y rediseño de anticuerpos.

En la actualidad, la técnica más ampliamente utilizada para la adaptación de anticuerpos al ser humano se conoce como "injerto de CDR”. La base científica de esta tecnología es que la especificidad de unión de un anticuerpo reside principalmente dentro de los tres bucles hipervariables conocidos como regiones determinantes de complementariedad (CDR) de sus regiones variables de las cadenas pesada y ligera (regiones V) , mientras que las regiones estructurales más conservadas (armazón, FW; región estructural, FR) proporcionan la función de soporte estructural. Al injertar las CDR en un FW seleccionado apropiadamente, parte o la totalidad de la actividad de unión al anticuerpo puede ser transferida al anticuerpo recombinante resultante. La primera demostración de la transferencia de la especificidad por el injerto de CDR fue para un nitrofenol hapteno (NP) (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986) ) .

Dado que la metodología para definir las CDR ha sido bien establecida, la clave para el injerto de CDR es la selección del aceptor de anticuerpo humano más apropiado para el injerto. Se han desarrollado diversas estrategias para seleccionar aceptores de anticuerpos humanos con las similitudes más altas con las secuencias de aminoácidos de las CDR donadoras o del FW donador, o con las estructuras donadoras. Todas estas estrategias de "mejor ajuste", aunque parecen muy racionales, se basan, de hecho, en una suposición, es decir, que un anticuerpo recombinante resultante que es lo más similar posible (en la secuencia de aminoácidos o en la estructura) al anticuerpo original será el que mejor conserve la actividad de unión al antígeno original. Aunque todas estas estrategias se han aplicado con éxito para generar anticuerpos terapéuticos (por ejemplo, Tempest et al., Biotechnology 9:266-71 (1991) , Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185 (1991) , Co et al., J. Immunol. 152:2968-76 (1994) ) , la hipótesis subyacente nunca ha sido probada seriamente.

Un problema potencial de las estrategias de mejor ajuste es que los criterios de mejor ajuste son matemáticos, pero no necesariamente biológicos. El ajuste medido por el grado de homología, por ejemplo, es la suma de los valores numéricos asignados a restos de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos idénticos, homólogos y diferentes. Aunque estos valores asignados han sido validados en gran medida en muchos otros sistemas de evaluación de la homología, las sutiles diferencias que pueden no ser significativas para otros sistemas podrían ser importantes para calcular los mejores ajustes en la adaptación de anticuerpos al ser humano.

Un problema relacionado es, dados dos aceptores con grado de ajuste total idéntico o muy cercano para el donador, su ajuste local en las diferentes FR puede ser diferente. Puede ser una región más importante que otra? Cómo se va a determinar eso? En resumen, todavía no se ha validado un modelo matemático para satisfacer el requisito de calcular los mejores ajustes en la relación donador-aceptor en la obtención de anticuerpos por ingeniería genética.

Una complicación adicional se refiere a las interacciones entre las dos cadenas de un anticuerpo: un aceptor de cadena pesada de mejor ajuste y un aceptor de cadena ligera de mejor ajuste pueden no ajustarse entre sí para conservar del mejor modo la actividad de unión del donador. No hay ninguna herramienta disponible para evaluar el ajuste entre cadenas. Los investigadores han apareado las cadenas pesadas y ligeras de varios anticuerpos frente a un mismo epítopo para tratar de encontrar un mejor apareamiento. Sin embargo, esto no se ha intentado en la adaptación de anticuerpos al ser humano.

En teoría, se han secuenciado todas las secuencias de la línea germinal humana y están disponibles para la búsqueda de los FW de anticuerpo. Sin embargo, en la práctica, la mayoría de las regiones V humanas que se han utilizado hasta ahora en la humanización de anticuerpos son de genes de anticuerpos maduros, con frecuencia los de las proteínas de mieloma. Es probable que contengan mutaciones somáticas. Estas mutaciones son únicas para el individuo del que provienen los genes reordenados, y por lo tanto serán vistos como extraños por otros individuos. Las secuencias de la base de datos de la línea germinal son más adecuadas para la humanización de anticuerpos desde esta perspectiva. Sin embargo, no están fácilmente disponibles secuencias de la base de datos de la línea germinal que codifiquen todo el FW para la humanización de anticuerpos, y sólo pueden generarse por combinación secuencias puras de genes V y J.

Otro problema de la utilización de genes de anticuerpos maduros para el FW aceptor es que no todas las posibles combinaciones de V-J para la cadena ligera o las combinaciones V-D-J para la cadena pesada están representadas en los genes maduros. Por lo tanto, pueden surgir situaciones en las que un gen V muy coincidente esté unido a un segmento J que coincide mal. La humanización del anticuerpo monoclonal anti-Tac de ratón descrita por Queen et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) ) es un ejemplo. La comparación de la región VH de anti-Tac con la base de datos NBRF-PIR (http://www.psc.edu/general/software/packages/nbrfpir/nbrf.html) indicaba que la región VH de la proteína de mieloma humano Eu tenía el grado más alto de homología (57% de identidad frente a VDJH) . Sin embargo, el armazón 4 de la región VH de Eu tiene varios aminoácidos, presumiblemente codificados por el segmento JH de Eu, que son atípicos de los segmentos JH humanos. Esto dio como resultado una mala coincidencia entre el armazón 4 de Eu y el de anti-Tac (figura 1) . La comparación separada de la región JH de anti-Tac (armazón 4 y el extremo proximal al armazón 4 de CDR3) con las secuencias de aminoácidos de los segmentos JH humanos funcionales conocidos (de los cuales existen 6; véase la figura 2) indica que la JH4 humana es una coincidencia mucho mejor que la JH de Eu. Este ejemplo sugiere que las comparaciones separadas de los elementos V y J son más ventajosas que la comparación de todas las regiones variables entre las secuencias de anticuerpos de roedor y de ser humano. Actualmente, no está fácilmente disponible una herramienta para este tipo de comparación separada.

No todos los aminoácidos en las CDR están implicados en la unión al antígeno. Por lo tanto, se ha propuesto que el injerto de sólo aquellos restos que sean críticos en la interacción antígeno-anticuerpo - el llamado injerto de restos determinantes de especificidad (injerto de SDR) - aumentará adicionalmente el contenido de secuencias de anticuerpo humano en el anticuerpo recombinante resultante (Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) ; Gonzales et al., Mol. Immunol. 40:337-49 (2004) ) . La aplicación de esta estrategia requiere información sobre la estructura del anticuerpo, así como sobre los restos de contacto del anticuerpo-antígeno, que con frecuencia no está disponible. Aun cuando esta información esté disponible, no hay un método sistemático para identificar de forma fiable los SDR, y el injerto de SDR permanece hasta ahora en su mayor parte en el nivel de investigación básica.

Recientemente se ha desarrollado una estrategia novedosa llamada "barajado de armazón humano", (Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ) . Esta técnica funciona por ligación de fragmentos de ADN que codifican las CDR a fragmentos de ADN que codifican FR1, FR2, FR3, y FR4 humanas, generando así una biblioteca de todas las combinaciones... [Seguir leyendo]

1. Método de selección de armazones de anticuerpos humanos para su uso en la preparación de un anticuerpo adaptado al ser humano, que comprende las etapas de:

a) obtener una secuencia peptídica para una región variable de un anticuerpo no humano; b) delimitar las secuencias peptídicas de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las regiones estructurales de la región variable no humana; c) construir una biblioteca de secuencias peptídicas para las regiones estructurales 1, 2, 3 y 4 del anticuerpo humano, codificadas por los genes de la línea germinal humana; d) seleccionar un subconjunto de secuencias peptídicas humanas miembros de la biblioteca que tengan una longitud idéntica a la de las regiones estructurales del anticuerpo maduro no humano; e) comparar la similitud de secuencia de las regiones estructurales de las secuencias peptídicas humanas seleccionadas con las secuencias peptídicas de las regiones estructurales no humanas; f) comparar la compatibilidad de longitud de CDR1 y CDR2 entre las secuencias peptídicas humanas seleccionadas y las secuencias peptídicas de las regiones estructurales no humanas; g) seleccionar un segundo subconjunto del subconjunto de secuencias peptídicas humanas seleccionadas de la etapa d) ; en la que las secuencias peptídicas seleccionados tienen una similitud de secuencia de las regiones estructurales superior a un valor “identity_threshold”, y la suma de la diferencia de longitud de CDR1 y CDR2 es inferior o igual a un valor “CDR12_length_compatibility_threshold”, en el que dicho valor “CDR12_length_compatibility_threshold” es 0 ó 1; y h) seleccionar los armazones representativos del segundo subconjunto de la etapa g) en base a un valor “librar y _size” y un valor “framework_region_redundancy”, en el que dicho valor “framework_region_redundancy” es de 1 a 3.

2. Método de preparación de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo adaptado al ser humano, que comprende el método según la reivindicación 1 y que comprende adicionalmente la etapa de:

i) construir una molécula quimérica que incluya cada una de las regiones CDR de la región variable no humana y las regiones estructurales de al menos un miembro de los armazones representativos de la cadena pesada y ligera humanas seleccionados en la etapa h) , en el que la molécula quimérica es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo adaptado al ser humano que se une al mismo antígeno que aquel al que se une el anticuerpo no humano.

3. Método según la reivindicación 2, que comprende adicionalmente la etapa de:

j) cribar cada combinación para detectar la afinidad de unión al antígeno y seleccionar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo óptimo adaptado al ser humano.

4. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el valor “identity_threshold” es de al menos un 60% para los armazones de la cadena pesada y ligera.

5. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el valor “librar y _size” es de 4 a 20.