Métodos para determinar ingredientes activos en conjugados PEG-proteína pro-fármaco con reactivos que pueden liberar PEG (despegilación in vitro).

Un método in vitro de liberación de un polímero soluble en agua ligado de manera reversible de una proteínamodificada mediante el polímero soluble en agua o aumento de la actividad de una proteína modificada con unpolímero soluble en agua ligado de manera reversible que comprende la etapa de incubar la proteína en condicioneseficaces para liberar el polímero soluble en agua,

en el que las condiciones eficaces para liberar el polímero solubleen agua comprenden aumentar la concentración de amina libre de un tampón que comprende la proteína por adiciónde lisina libre, histidina o una combinación de las mismas al tampón en una concentración eficaz para liberar elpolímero soluble en agua.

Métodos para determinar ingredientes activos en conjugados PEG-proteína pro-fármaco con reactivos que pueden liberar PEG (despegilación in vitro) .

La invención se refiere en general al desarrollo de sistemas de ensayo in vitro para forzar la liberación de un polímero soluble en agua, tal como polietilenglicol (PEG) y poli (ácido siálico) (PSA, por sus siglas en inglés) , de proteínas modificadas con un polímero soluble en agua ligado de manera reversible. La invención incluye métodos para analizar la liberación del polímero soluble en agua y medir la actividad recuperada de las proteínas. La invención incluye además métodos apropiados para el control de calidad de proteínas modificadas con polímeros solubles en agua que se pueden liberar, incluyendo polímeros como PEG y PSA.

La ausencia o disfunción de Factor VIII de la coagulación sanguínea (FVIII) está asociada al trastorno hemorrágico hemofilia A. El tratamiento de elección para la gestión de la hemofilia A es el tratamiento de sustitución con concentrados de FVIII procedentes de plasma o recombinantes (rFVIII) . Se acepta en general que los pacientes con hemofilia A grave, es decir con niveles de FVIII por debajo de 1%, se tratan mejor mediante un tratamiento profiláctico con la intención de mantener los niveles de FVIII por encima de 1% entre dosis. Teniendo en cuenta las semividas promedio de los diversos productos de FVIII en la circulación, esta concentración de circulación se puede conseguir normalmente por administración de FVIII dos a tres veces a la semana. Para aumentar la conveniencia del tratamiento profiláctico actual, el desarrollo de un producto de la próxima generación con propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas mejoradas, al tiempo que se mantienen todas las demás características del producto, se prevé permitir la dosificación sobre una base semanal.

Los fármacos de polipéptidos terapéuticos no sólo se exponen a enzimas proteolíticas y anticuerpos de neutralización, sino que también son propensos a la eliminación de la circulación mediante absorción celular mediada por receptor. Estos casos están asociados a una reducción en la semivida y tiempo de circulación de las proteínas aplicadas, que limita de ese modo su eficacia terapéutica. La modificación de los fármacos de polipéptidos con polímeros tales como PEG se ha demostrado que los protege de la degradación enzimática y la eliminación en una extensión significativa, mejorando de ese modo sus perfiles farmacodinámico y farmacocinético. Además, la PEGilación puede conducir a inmunogenicidad disminuida, estabilidad física y térmica aumentada, solubilidad aumentada, estabilidad líquida aumentada y aglutinación reducida.

La PEGilación se consigue normalmente por la unión covalente de una o más cadenas de PEG por monómero a un fármaco de polipéptidos. El enlace estable de PEG a proteínas presenta la desventaja de disminuir la función biológica de la proteína de una manera irreversible. Esto se puede evitar por modificación de las proteínas con un PEG ligado de manera reversible, que presenta el potencial para disociarse de la proteína con el tiempo. Este tipo de PEG que se puede liberar debería permitir la liberación de la proteína natural, acompañado por una recuperación completa de la actividad de la proteína natural. La patente de EE.UU. A-2008/234193 describe conjugados de Factor von Willebrand-polímero y conjugados de Factor VIII-polímero, teniendo cada uno un enlace que se puede liberar. F. Bedu-Addo et al., AAPS PharmaSci 2.002, 4 (4) , páginas 1-3, describen el desarrollo de la preformulación de Estafilocinasa SY161 pegilada recombinante usando métodos de diseño estadísticos para comprender los efectos de resistencia al tampón, concentración de NaCl y pH sobre la conformación y estabilidad de la proteína. La patente de EE.UU. A-2006/160948 describe una construcción proteínica (también denominada como polímero-VWFconjugado) que comprende factor von Willebrand (VWF) plasmático y/o recombinante, estando dicho VWF unido a al menos una molécula polimérica fisiológicamente aceptable, así como a un complejo entre dicha construcción proteínica y al menos una proteína de factor VIII (FVIII) . La molécula polimérica fisiológicamente aceptable puede ser, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o poli (ácido siálico) (PSA) . Y. Shechter et al., Europeun Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2.008, 70, 19-28, describen la pegilación reversible de insulina que facilita su acción prolongada in vivo. M. Nesher et al., Bioconjugate Chem. 2.008, 19, 342-348, describen que la pegilación reversible prolonga el efecto hipotensor de péptido natriurético atrial. H. Tsuber y et al., Journal of Biological Chemistr y 2.004, 279, 38.118-38.124, describen la prolongación de la acción de fármacos de proteína y péptido por una propuesta de modificación de polietilenglicol reversible. La patente internacional WO-A-2007/025988 describe una composición farmacéutica que comprende una hormona del crecimiento pegilada, en la que dicha hormona del crecimiento pegilada comprende hormona del crecimiento y un PEG, en la que dicha hormona del crecimiento y dicho PEG están unidos por un enlace oxima y opcionalmente por un ligador, teniendo dicha formulación un pH de 7

o inferior.

La invención se aplica a una o más necesidades en la técnica relativas al desarrollo de sistemas de ensayo in vitro para forzar la liberación de un polímero soluble en agua, tal como polietilenglicol (PEG) y poli (ácido siálico) (PSA) , de proteínas modificadas con un polímero soluble en agua ligado de manera reversible. La invención incluye métodos para analizar la liberación del polímero soluble en agua y medir la actividad recuperada de las proteínas. La invención además incluye métodos apropiados para el control de calidad de proteínas modificadas con polímeros solubles en agua que se pueden liberar.

En una realización, la invención incluye métodos para liberar un polímero soluble en agua ligado de manera reversible de una proteína modificada mediante el polímero soluble en agua. En otra realización, la invención incluye métodos para aumentar la actividad de una proteína modificada mediante un polímero soluble en agua ligado de manera reversible. Ambos métodos comprenden la etapa de incubar la proteína en una o más condiciones eficaces para liberar el polímero soluble en agua. Así, la invención incluye una combinación de condiciones eficaces para liberar el polímero soluble en agua. En particular, la presente invención como se definió en las reivindicaciones adjuntas se refiere a un método in vitro de liberación de un polímero soluble en agua ligado de manera reversible de una proteína modificada mediante el polímero soluble en agua o aumento de la actividad de una proteína modificada con un polímero soluble en agua ligado de manera reversible que comprende la etapa de incubar la proteína en condiciones eficaces para liberar el polímero soluble en agua, en el que las condiciones eficaces para liberar el polímero soluble en agua comprenden aumentar la concentración de amina libre de un tampón que comprende la proteína por adición de lisina libre, histidina o una combinación de las mismas al tampón en una concentración eficaz para liberar el polímero soluble en agua. En una realización preferida de la presente invención, las condiciones comprenden además aumentar el pH del tampón que comprende la proteína, aumentar la temperatura del tampón que comprende la proteína o prolongar el periodo de tiempo de la etapa de incubación. Según una realización preferida en particular, el pH del tampón se aumenta a aproximadamente pH 8, 1. Según una realización preferida en particular más, el pH del tampón se aumenta a aproximadamente pH 9, 8, Según otra realización preferida en particular, la temperatura del tampón se aumenta de aproximadamente 4°C a aproximadamente 37°C. En otra realización preferida en particular, el periodo de tiempo para incubación se prolonga a aproximadamente 168 horas. En otra realización preferida en particular, el periodo de tiempo para incubación se prolonga a aproximadamente 48 horas. En una realización preferida más de la presente invención, la proteína es factor VIII (FVIII) . En otra realización preferida, la proteína es Factor von Willebrand (VWF) . Preferiblemente, el polímero soluble en agua está ligado de manera reversible a la proteína con 9H- (f) luoren-9-il (m) et (o) xi (c) arbonilo, dibenzofulveno o un derivado de los mismos. En este contexto, se prefiere en particular que el polímero soluble en agua esté ligado con 9H- (f) luoren-9il (m) et (o) xi (c) arbonilo o un derivado del mismo. En una realización preferida más de la presente... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro de liberación de un polímero soluble en agua ligado de manera reversible de una proteína modificada mediante el polímero soluble en agua o aumento de la actividad de una proteína modificada con un polímero soluble en agua ligado de manera reversible que comprende la etapa de incubar la proteína en condiciones eficaces para liberar el polímero soluble en agua, en el que las condiciones eficaces para liberar el polímero soluble en agua comprenden aumentar la concentración de amina libre de un tampón que comprende la proteína por adición de lisina libre, histidina o una combinación de las mismas al tampón en una concentración eficaz para liberar el polímero soluble en agua.

2. El método según la reivindicación 1, en el que las condiciones comprenden además aumentar el pH del tampón que comprende la proteína, aumentar la temperatura del tampón que comprende la proteína o prolongar el periodo de tiempo de la etapa de incubación.

3. El método según la reivindicación 2, en el que el pH del tampón se aumenta a aproximadamente pH 8, 1.

4. El método según la reivindicación 2, en el que el pH del tampón se aumenta a aproximadamente pH 9, 8.

5. El método según la reivindicación 2, en el que la temperatura del tampón se aumenta de aproximadamente 4°C a aproximadamente 37°C.

6. El método según la reivindicación 2, en el que el periodo de tiempo para incubación se prolonga a aproximadamente 168 horas.

7. El método según la reivindicación 2, en el que el periodo de tiempo para incubación se prolonga a 20 aproximadamente 48 horas.

8. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína es factor VIII (FVIII) .

9. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína es Factor von Willebrand (VWF) .

10. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el polímero soluble en agua está ligado de manera reversible a la proteína co.

9. (f) luoren-9-il (m) et (o) xi (c) arbonilo, dibenzofulveno o un derivado de los mismos.

11. El método según la reivindicación 10, en el que el polímero soluble en agua está ligado co.

9. (f) luoren-9il (m) et (o) xi (c) arbonilo o un derivado del mismo.

12. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el polímero soluble en agua es polietilenglicol.

13. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el polímero soluble en agua es poli (ácido siálico) .