Métodos para conservar órganos y tejidos.

Un método ex vivo para conservar un órgano o tejido que comprende poner en contacto el órgano o tejido con unacantidad eficaz de un inhibidor de calicreina,

en el que el inhibidor de calicreína es un polipéptido que consiste en losaminoácidos 3-60 de SEO ID NO: 2 o un polipéptido que consiste en SEO ID NO: 2.

Métodos para conservar órganos y tejidos.

Solicitud relacionada Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional U.S. No. 60/407.004, presentada el 28 de agosto, 2002.

Las enseñanzas completas de la solicitud anterior se incorporan en la presente memoria por referencia.

Antecedentes de la invención La conservación de la viabilidad de los órganos donantes es un objetivo importante para el trasplante de órganos. Típicamente, el órgano que se va a trasplantar debe almacenarse y transportarse al receptor posible. La capacidad para prolongar la viabilidad celular del órgano durante el almacenamiento y transporte es muy importante para el éxito de la operación de trasplante. Las disoluciones de conservación juegan un papel importante en la longevidad del órgano. Las disoluciones para la conservación de órganos incluyen las descritas por Berdyaev et al., Pat. U.S. No. 5.432.053; Belzer et al., Pat. U.S. Nos. 4.798.824, 4.879.283 Y4.873.230; Taylor, Pat. U.S. No. 5.405.742; Dohi et al., Pat. U.S. No. 5.565.317; Stern el al., Pat. U.S. Nos. 5.370.989 Y5.552.267, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad. Sin embargo, existe una necesidad de métodos y disoluciones mejoradas para la conservación de órganos.

Las proteasas están implicadas en un amplio rango de rutas biológicas. En particular, las serina proteasas tales como calicreína, plasmina, elastasa, activador del plasminógeno uroquinasa, trombina, inhibidor de la coagulación asociado con la lipoproteína humana y los factores de coagulación tales como los factores Vlla, IXa, Xa, Xla y Xlla se han implicado en rutas que influyen en el flujo sanguíneo, por ejemplo, isquemia general y focal, invasión tumoral, fibrinolisis, pérdida de sangre perioperatoria e inflamación. Los inhibidores de serina proteasas específicas, por lo tanto, han recibido atención como dianas potenciales de fármacos para varias enfermedades isquémicas.

Uno de dichos inhibidores, aprotinina (también denominada inhibidor de la tripsina pancreática bovina o BPTI) , obtenida de pulmón bovino, se ha aprobado en los Estados Unidos para uso profiláctico en la reducción de pérdida de sangre perioperatoria y la necesidad de transfusión en pacientes sometidos a CPB, por ejemplo, en el curso de un procedimiento de injerto de bypass arterial coronario. La aprotinina está disponible comercialmente con el nombre registrado TRASYLOL® (Bayer Gorporation Pharmaceutical Division, West Haven, Gonnecticut) y fue aprobada previamente para uso para tratar pancreatitis. La eficacia de la aprotinina está asociada con sus capacidades relativamente no específicas para inhibir una variedad de serina proteasas, incluyendo la calicreína plasmática y plasmina. Estas proteasas son importantes en varias rutas del sistema de activación por contacto (GAS) .

GAS se activa inicialmente cuando la sangre completa se pone en contacto con la superficie de sustratos extraños (por ejemplo, caolín, vidrio, sulfato de dextrano o superficie óseas dañadas) . La calicreína, una serina proteasa, es una enzima plasmática que inicia la cascada GAS dando lugar a la activación de neutrófilos, plasmina, coagulación y varias quininas. La calicreína se secreta como un zimógeno (pre-calicreína) que circula como una molécula inactiva hasta que es activada por un evento proteolítico pronto en la cascada de activación por contacto.

Sin embargo, el uso de inhibidores específicos de calicreína para la conservación de órganos no se ha demostrado con éxito.

U.S. 3.682.776 describe la conservación de órganos, tejidos y productos alimenticios por contacto con inhibidores de proteasas biológicos. WO 93/14122 describe una variante del dominio I del inhibidor de proteasa de tipo Kunitz humano del inhibidor de la ruta del factor tisular. WO 00/14235 describe inhibidores de proteasa que comprenden un dominio Kunitz. WO 95/21601 describe dominios Kunitz homólogos a BPTI que inhiben una o más calicreínas plasmáticas y/o tisulares. WO 03/103475 describe métodos para prevenir o reducir la isquemia y/o una respuesta inflamatoria sistémica en un paciente usando péptidos que inhiben serina proteasas.

Sumario de la invención Esta descripción se basa en el descubrimiento de péptidos que inhiben las serina proteasas, tales como, por ejemplo, calicreína, que pueden emplearse con éxito para conservar un órgano pendiente de trasplante. Más específicamente, la descripción proporciona métodos para usar inhibidores de calicreína en un método para conservar un órgano o tejido y composiciones para dicho uso. La descripción también se refiere a métodos para reducir, inhibir o prevenir la lesión o daño por reperfusión en un órgano o tejido que se ha extraído de su huésped y a composiciones para dicho uso. Los péptidos de calicreína preferidos incluyen aquellos descritos en las Patentes de Estados Unidos Nos. 6.333.402 y 6.057.287 de Markland el al., cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad.

En un caso particularmente preferido, la descripción está dirigida a composiciones que comprenden un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos:

Xaal Xaa2 Xaal Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 XaaS Xaa9 XaalO Xaall G) y Xaa13 Cys XaalS Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26

Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa3S 01y 01y Cys Xaa39

Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa4S Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 xaaSo Cys XaaS2 XaaS3 Xaa54 Cys XaaS6 XaaS7 XaaS8 (SEQ ID NO: 1) ,

en la que Xaa1 , Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 son cada uno individualmente un aminoácido o están ausentes; Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa20, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27, Xaa28, Xaa29, Xaa41 , Xaa42, Xaa44 , Xaa46, Xaa47, Xaa48, Xaa49, Xaa50, Xaa52, Xaa53 y Xaa54 pueden ser cualquier aminoácido; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Asp y Glu; Xaa11 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Asp, Gly, Ser, Val, Asn, lIe, Ala y Thr; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys y Gln; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn y Gln; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Gly, Ser, Asp y Asn; Xaa17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Asn, Ser, lIe, Gly, Val, Gln y Thr; Xaa18 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: His, Leu, Gln y Ala; Xaa19 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Pro, Gln, Leu, Asn elle; Xaa21 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Trp, Phe, Tyr, His elle; Xaa22 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe; Xaa23 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe; Xaa31 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, lIe y Thr; Xaa32 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Gln, Asp, Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly y Val; Xaa34 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Thr, lIe, Ser, Val, Ala, Asn, Gly y Leu; Xaa35 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr, Trp y Phe; Xaa39 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Gly, Ala, Ser y Asp; Xaa40 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Gly y Ala; Xaa43 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Asn y Gly; Xaa45 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Phe y Tyr; y en el que dicho polipéptido inhibe la calicreína y a métodos para usar dichas composiciones.

En un caso particular, las posiciones de aminoácidos específicos pueden ser las siguientes: Xaa6 puede ser Ala, Xaa7 puede ser Phe, Xaa8 puede ser Lys, Xaa9 puede ser Ala, Xaa10 puede ser Asp, Xaa11 puede ser Asp, Xaa13 puede ser Pro, Xaa15 puede ser Arg, Xaa16 puede ser Ala, Xaa17 puede ser Ala, Xaa18 puede ser His, Xaa19 puede ser Pro, Xaa20 puede ser Arg, Xaa24 puede ser Asn, Xaa25 puede ser lIe, Xaa26 puede ser Phe, Xaa27 puede ser Thr, Xaa28 puede ser Arg, Xaa29 puede ser Gln, Xaa31 puede ser Glu, Xaa32 puede ser Glu, Xaa34 puede ser lIe, Xaa35 puede ser Tyr, Xaa39 puede ser Glu, Xaa41 puede ser Asn, Xaa42 puede ser Arg, Xaa44 puede ser Arg, Xaa46 puede ser Glu, Xaa47 puede ser Ser, Xaa48 puede ser Leu, Xaa49 puede ser Glu y/o Xaa50 puede ser Glu; cualquiera de estos aminoácidos específicos en estas posiciones puede ocurrir individualmente o en combinación con uno o más de los aminoácidos en una o más posiciones descritas de otra manera.

En un caso particular, la presente descripción está dirigida a una composición que comprende un polipéptido como se ha descrito... [Seguir leyendo]

1. Un método ex vivo para conservar un órgano o tejido que comprende poner en contacto el órgano o tejido con una cantidad eficaz de un inhibidor de calicreina, en el que el inhibidor de calicreína es un polipéptido que consiste en los aminoácidos 3-60 de SEO ID NO: 2 o un polipéptido que consiste en SEO ID NO: 2.

2. Un método ex vivo para reducir el daño por reperfusión de un órgano durante cirugía y/o después de la extracción del órgano de un sujeto, que comprende poner el órgano en una disolución de almacenamiento y conservación de órganos, en el que la disolución comprende un inhibidor de calicreína, en el que el inhibidor de calicreína es un polipéptido que consiste en los aminoácidos 3-60 de SEO ID NO: 2 o un polipéptido que consiste en SEO ID NO: 2.

3. El método de la Reivindicación 1 o Reivindicación 2, en el que el órgano o tejido es corazón, pulmón, riñón, páncreas, hígado, intestino, tejido endotelial, tejido vascular o piel.

4. Una composición para conservar y/o almacenar un órgano que comprende una disolución de conservación de órganos ex vivo fisiológicamente aceptable y un polipéptido que consiste en los aminoácidos 3-60 de SEO ID NO: 2

o un polipéptido que consiste en SEO ID NO: 2,

en el que la disolución de conservación de órganos ex vivo se selecciona del grupo que consiste en:

una disolución de conservación de órganos que comprende 3% a 8% hidroxietil almidón, Na+ a 30±5 mM, K+ a 120±5 mM, mOsmllitro de 320±5 y trimetoprim a 16 mg/mL y sulfametoxazol a 80 mg/mL, pH 7, 4;

una disolución de conservación de órganos que comprende, por litro, 50 g hidroxietil almidón, 100 mmoles K+lactobionato, 25 mmoles KH2P04, 5 mmoles MgS04, 30 mmoles rafinosa, 5 mmoles adenosina, 3 mmoles glutatión, 100 U insulina, 0, 5 mL Bactrim, 8 mg dexametasona y 1 mM alopurinol;

una disolución de conservación de órganos que comprende 85 mM a 145 mM NaCI, 3 mM a 6 mM KCI, 1, 0 mM a 1, 6 mM CaCh, 0, 7 mM a 1, 3 mM KH2P04, 0, 9 mM a 1, 5 mM MgS04; 0, 05 mM a 5, 0 mM alopurinol, 0, 02 mM a 2, 0 mM desferrioxamina, 0, 5 mM a 10, 0 mM glutatión, O, 1 ~M a 5, 0 ~M nicardipeno, 0, 1 mM a 5, 0 mM adenosina, 1, 0 mM a 50, 0 mM fructosa, 1, 0 mM a 50, 0 mM glucosa, 5 U/L a 250 U/L insulina, 2 mM a 40 mM MOPS y 30 gIL a 100 gIL de un hidroxietil almidón modificado al 10%;

una disolución de conservación de órganos que comprende 50g/L de 10% hidroxietil almidón modificado, 115 mM NaCI, 5 mM KCI, 1, 30 mM CaCI2, 1 mM KH2P04, 1, 2 mM MgS04, 1 mM alopurinol, 1 mM desferrioxamina, 3 mM glutatión, 2 ~M nicardipeno, 1 mM adenosina, 10 mM fructosa, 10 mM glucosa, 100 U/L insulina y 20 mM MOPS, pH

6, 5;

una disolución de conservación de órganos que comprende 85 mM a 145 mM NaCI, 3 mM a 6 mM KCI, 1, 0 mM a 1, 6 mM CaCI2, 0, 7 mM a 1, 3 mM KH2P04, 0, 9 mM a 1, 5 mM MgS04, y 0, 12 mM a 1, 2 mM adenosina; y

una disolución de conservación de órganos que comprende 115 mM NaCI, 5 mM KCI, 1, 30 mM CaCh, 1 mM KH2P04, 1, 2 mM MgS04, 1 mM alopurinol, 1 mM desferrioxamina, 3 mM glutatión y 0, 12 mM adenosina.

5. La composición de la Reivindicación 4, en la que la composición comprende además al menos un antioxidante.

Figura 1

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A.parato de Bypass Extrínsec.a >lntrínseca ... ..

coagulación ReperfusIOn u¡n¡na !'LAS..... ' ", . . ....... ... , ...... ! Le.cocitos

A.ctivación de

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Figura 2

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ACG A'l'G AGA TTC CCA !'CT A'l'C 2'TC ACT GC'T Gn' TTG nc GC2' Gel' H R F PSI r T A V L F A A

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FIGURA 3

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