Métodos de detección de células tumorales circulantes y métodos de diagnóstico del cáncer en un sujeto mamífero.

Método de detección de células tumorales epiteliales circulantes en un sujeto mamífero con posible diagnóstico decáncer,

que comprende:

(i) montar una muestra de ensayo en un sustrato, proviniendo la muestra de ensayo de sangre del sujeto,comprendiendo la muestra de ensayo una población de células que no ha sido enriquecida en célulastumorales circulantes;

(ii) detectar la presencia o ausencia de un primer marcador en la muestra de ensayo, en la que el primermarcador es específico para las células tumorales epiteliales circulantes y es un marcador citoqueratina;

(iii) detectar la presencia o ausencia de un segundo marcador en las células de la población de células o deun subconjunto de la población de células, en el que el segundo marcador es la morfología celular, el tamañocelular o la relación núcleo/citoplasma, y se detecta con una tinción citológica; y

(iv) analizar la población de células detectada por los marcadores primero y segundo para identificar lascélulas tumorales epiteliales circulantes.

Métodos de detección de células tumorales circulantes y métodos de diagnóstico del cáncer en un sujeto mamífero

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La descripción se refiere en general a un método para detectar células tumorales epiteliales circulantes en un sujeto mamífero y a métodos de diagnóstico del cáncer en un sujeto mamífero. Los métodos de detección o diagnóstico indican la presencia de cáncer metastásico o un cáncer en estadio temprano.

ANTECEDENTES

Se han observado células tumorales epiteliales circulantes (CTC) en sangre periférica de pacientes con cánceres de origen epitelial a concentraciones ultrabajas de 1 en 106 a 107 células mononucleares de sangre periférica. Kraeft et al., Clin. Cancer Res. 10:3020-3028, 2004; Kraeft et al., Methods Mol. Med. 75:423-430, 2003; Meng et al., Clin. Cancer Res. 10:8152-8162, 2004; Witzig et al., Clin. Cancer Res. 8:1085-1091, 2002; Pantel et al., Curr. Opin. Oncol. 12:95-101, 2000; Gross et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92:537-541, 1995. Se ha demostrado que el número de estas células se correlaciona con los resultados para las cohortes de pacientes con cáncer de mama metastásico con enfermedad progresiva en el momento del muestreo. Cristofanilli et al., N. Engl. J. Med. 351:781-91, 2004. Por lo tanto, su caracterización es de considerable interés biomédico con el fin de entender cómo estas células pueden viajar a través del torrente sanguíneo a sitios anatómicamente distantes y dar lugar a una enfermedad metastásica. Por consiguiente, un instrumento para medir estas células podría ser una valiosa herramienta de diagnóstico.

La metástasis hematógena es la principal causa de mortalidad en el cáncer de mama, lo que contribuye a una estimación de 41.000 muertes en los Estados Unidos en 2005. Jemal et al. Cancer J. Clin. 55:10-30, 2005. Las pruebas indican que las células tumorales se desprenden de la masa tumoral primaria al torrente sanguíneo. Tarin, Cancer Metastasis Rev. 1:215-225, 1982; Tarin et al., Cancer Res. 41:3604-3609, 1981; Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96:4.494-4.499, 1.999; Liotta et al., Cell 64:327-336, 1991. Los factores implicados en la supervivencia de las CTC en la sangre y la metástasis final no son bien comprendidos. Chambers et al., Breast Cancer Res. 2:400-407, 2000. Las CTC observadas en la sangre periférica de pacientes con cánceres de origen epitelial pueden identificarse utilizando ensayos de inmunofluorescencia por medio de anticuerpos monoclonales dirigidos contra citoqueratinas (CK) , u otros marcadores específicos de células epiteliales. Moll, Subcell Biochem 31:205-262, 1998; Pantel et al., J. Hemalother 3:165-173, 1994 Los ensayos clínicos prospectivos han establecido que estas células CK+ son malignas y su presencia en la sangre se correlaciona con un resultado desfavorable y una menor tasa de supervivencia, en varios estudios. Fehm et al., Clin. Cancer Res. 8:2073-2084, 2002. Cristofanilli et al., N. Engl. J. Med. 351:781-791, 2004; Cristofanilli et al., J. Clin. Oncol. 23:1420-1430, 2005; Pierga et al., Clin. Cancer Res. 10:1392-1400, 2004.

El método más fiable actualmente disponible para la detección de CTC es la microscopía digital automatizada (MDA) mediante análisis de imágenes para el reconocimiento de las células tumorales marcadas inmunocitoquímicamente. Sin embargo, la MDA tiene la desventaja de unas velocidades de exploración muy lentas de 800 células/segundo. Kraeft et al., Clin. Cancer Res. 10:3020-8, 2004. La velocidad de exploración de la MDA está limitada por la latencia asociada con el hecho de desplazar por etapas la muestra muchas veces debido al limitado campo de visión.

Para salvar esta limitación de velocidad, se han desarrollado varias tecnologías de enriquecimiento de CTC para reducir el número total de células que necesitan ser exploradas. Hager et al., Gynecol Oncol. 98:211-6, 2005; Rosenberg et al., Cytometr y 49:150-8, 2002; Witzig et al., Clin. Cancer Res. 8:1085-1091, 2002; Umiel et al., J Hematother Stem Cell Res. 9:895-904, 2000; Siewert et al., Recent Results Cancer Res 158:51-60, 2001; el documento de EE.UU. 6.670.197 y Vona et al., American Journal of Pathology, 156, 1, enero de 2000. Hasta la fecha el más exitoso de estos métodos de enriquecimiento es el enriquecimiento inmunomagnético (EIM) . Smirnov et al., Cancer Res. 65:4993-7, 2005; Allard et al., Clin. Cancer Res. 10:6897-904, 2004; Cristofanilli et al., N. Engl. J. Med. 351:781-91, 2004; el documento de EE.UU. 2003/129676. En la mayoría de las aplicaciones de EIM, se dirigen anticuerpos monoclonales conjugados con pequeñas perlas magnéticas a la molécula de adhesión celular epitelial, EpCAM. A continuación, se manipulan las perlas en los campos magnéticos para el enriquecimiento. Sin embargo, se sabe que los niveles de expresión de EpCAM en las CTC están sustancialmente reducidos frente a los niveles de las células en los tejidos. Rao et al., Int. J. Oncol. 27:49-57, 2005. Puesto que se observó una pérdida de sensibilidad en el enriquecimiento de células con expresión de EpCAM reducida, este método podría tener una baja sensibilidad para algunas CTC. Krivacic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 101:10501-4, 2004.

Motivado por las limitaciones de la tecnología disponible, se ha desarrollado un instrumento de exploración que utiliza la tecnología de exploración de matriz de fibra óptica (FAST) que puede localizar las CTC a una velocidad 500 veces superior a la de la MDA con una sensibilidad comparable y una especificidad mejorada y, por consiguiente, no requiere una etapa de enriquecimiento. Krivacic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 101:10501-4, 2004; Curr y et al., Proc. de la 26ª conferencia internacional anual de la IEEE EMBS, San Francisco, CA, EE.UU., 1 al 5 de septiembre, 2004. El instrumento de exploración incluye un sistema de captación de luz que tiene un campo de visión muy amplio (50 mm) , sin pérdida de la eficacia de captación. Esta amplia abertura de captación (un aumento de 100 veces en comparación con la MDA) se aplica con un haz delgado y extenso de filtros ópticos que captan la emisión fluorescente. Este campo de visión es lo suficientemente grande como para permitir una exploración continua y eliminar la necesidad de desplazamiento por etapas de la muestra, que es la principal fuente de latencia.

En la actualidad, las CTC se detectan y analizaron principalmente a través de marcadores inmunocitoquímicos tales como CK y el uso de tinción nuclear con DAPI. Aunque estos métodos han tenido éxito en la enumeración y distinción de las CTC, se diferencian de los métodos citopatológicos convencionales, ya que omiten la correlación con la tinción morfológica convencional de la que depende el diagnóstico patológico. Cristofanilli et al., N. Engl. J. Med. 351:781-791, 2004; Fehm et al., Cytotherapy 7:171-185, 2005 Esto crea dificultades a la hora de comparar las CTC con células tumorales de otros sitios obtenidas mediante procedimientos de diagnóstico de rutina. Aunque la capacidad de detectar las CTC tiene el potencial de ayudar en el diagnóstico y tratamiento individualizado del cáncer y en la eficacia del tratamiento, podría mejorarse la comprensión de la biología de las CTC incluyendo métodos citopatológicos convencionales. Existe la necesidad en la técnica de utilizar imágenes detalladas de alta resolución de las CTC con métodos de tinción convencionales para el diagnóstico patológico y la microscopía de campo claro para conferir el potencial de realizar un diagnóstico citopatológico convencional de carcinoma circulante y avanzar en la adopción de un diagnóstico utilizando las CTC en la práctica clínica.

RESUMEN

La invención proporciona un método para detectar células tumorales epiteliales circulantes en un sujeto mamífero con posible diagnóstico de cáncer que comprende:

(i) montar una muestra de ensayo en un sustrato, proviniendo la muestra de ensayo de sangre del sujeto, comprendiendo la muestra de ensayo una población de células que no ha sido enriquecida en células tumorales circulantes;

(ii) detectar la presencia o ausencia de un primer marcador en la muestra de ensayo, en el que el primer marcador es específico para las células tumorales epiteliales circulantes y es un marcador citoqueratina;

(iii) detectar la presencia o ausencia de un segundo marcador en las células de la población de células o de un subconjunto de la población de células, en el que el segundo marcador es la morfología celular, el tamaño celular o la relación núcleo/citoplasma, y se detecta con una tinción citológica; y

(iv) analizar la población de células detectadas por los marcadores primero y segundo para identificar las células tumorales epiteliales... [Seguir leyendo]

1. Método de detección de células tumorales epiteliales circulantes en un sujeto mamífero con posible diagnóstico de cáncer, que comprende:

(i) montar una muestra de ensayo en un sustrato, proviniendo la muestra de ensayo de sangre del sujeto, comprendiendo la muestra de ensayo una población de células que no ha sido enriquecida en células tumorales circulantes;

(ii) detectar la presencia o ausencia de un primer marcador en la muestra de ensayo, en la que el primer marcador es específico para las células tumorales epiteliales circulantes y es un marcador citoqueratina;

(iii) detectar la presencia o ausencia de un segundo marcador en las células de la población de células o de un subconjunto de la población de células, en el que el segundo marcador es la morfología celular, el tamaño celular o la relación núcleo/citoplasma, y se detecta con una tinción citológica; y

(iv) analizar la población de células detectada por los marcadores primero y segundo para identificar las células tumorales epiteliales circulantes.

2. Método según la reivindicación 1 en el que el sustrato es un sustrato plano.

3. Método según la reivindicación 1 en el que el montaje de la muestra de ensayo en el sustrato forma una monocapa biológica.

4. Método según la reivindicación 1 en el que el primer marcador se detecta utilizando un marcador fluorescente.

5. Método según la reivindicación 1 que comprende adicionalmente analizar la población de células por el detalle nuclear, el contorno nuclear, la presencia o ausencia de nucléolos, la calidad del citoplasma o la cantidad de citoplasma.

6. Método según la reivindicación 1 que comprende adicionalmente analizar la población de células midiendo las células intactas con una relación núcleo/citoplasma alta, las células intactas con una relación núcleo/citoplasma baja, las células apoptósicas tempranas o las células apoptósicas tardías, e identificar las células tumorales circulantes.

7. Método según la reivindicación 1 en el que la detección del primer marcador comprende adicionalmente analizar la población de células fijando las células al sustrato, explorando la población de células en el sustrato mediante una matriz de fibra óptica y formando imágenes de las células por microscopía digital mediante una relocalización.

8. Método según la reivindicación 7 en el que la detección del segundo marcador comprende adicionalmente relocalizar las células epiteliales identificadas por el primer marcador mediante microscopía digital.

9. Método de cribado de un compuesto candidato a fármaco para el tratamiento de un cáncer epitelial en un sujeto mamífero, comprendiendo dicho método:

(I) montar unas muestras de ensayo primera y segunda en un sustrato, siendo la primera muestra una muestra de sangre de un sujeto con posible diagnóstico de cáncer antes de tratar al sujeto con el compuesto candidato a fármaco y siendo la segunda muestra de ensayo una muestra de sangre del sujeto después del tratar al sujeto con el compuesto candidato a fármaco, comprendiendo las muestras de ensayo una población de células que no ha sido enriquecida en células tumorales circulantes;

(ii) detectar la presencia o ausencia de un primer marcador en las muestras de ensayo en las que el primer marcador es específico para las células tumorales epiteliales circulantes y es un marcador citoqueratina;

(iii) detectar la presencia o ausencia de un segundo marcador en las células de la población de células o de un subconjunto de la población de células, en el que el segundo marcador es la morfología celular, el tamaño celular, o la relación núcleo/citoplasma, y se detecta con una tinción citológica; y

(iv) analizar la población de células detectada por los marcadores primero y segundo para identificar las células tumorales epiteliales circulantes en las muestras de ensayo antes del tratamiento con el compuesto candidato a fármaco en comparación con después del tratamiento con el compuesto candidato a fármaco; en el que la presencia de una disminución del número de células tumorales epiteliales circulantes en la muestra después del tratamiento en comparación con un número de células epiteliales tumorales circulantes en la muestra antes del tratamiento indica la eficacia del compuesto candidato a fármaco en el tratamiento del cáncer en el sujeto mamífero.