Métodos, agentes y ensayos de detección de compuestos para inducir diferenciación de células de mamífero no diferenciadas para dar lugar a osteoblastos.

Método para identificar un compuesto que induce diferenciación de células de mamíferos no diferenciadas paradar lugar a osteoblastos,

que comprende:

(a) poner en contacto un compuesto con una fosfodiestearasa 11A, PDE11A, polipéptido, y

(b) medir una propiedad de compuesto-polipéptido relacionada con la diferenciación de dichas células;en el que:

i) dicho polipéptido es una preparación in vitro libre de células y dicha propiedad es una afinidad de enlace de dichocompuesto a dicho polipéptido, y

ii) dicha propiedad es la activación de un mecanismo biológico que produce un marcador bioquímico indicador de ladiferenciación de dichas células

Métodos, agentes y ensayos de detección de compuestos para inducir diferenciación de células de mamífero no diferenciadas para dar lugar a osteoblastos 5

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de las enfermedades de mamíferos que implican una disminución sistémica o local de la densidad ósea media.

Antecedentes de la invención El hueso contiene dos estructuras celulares distintas, es decir, células de formación ósea (por ejemplo, osteoblastos) y células de resorción ósea (por ejemplo, osteoclastos) . El hueso es un tejido dinámico que se destruye continuamente (está sometido a resorción) y se reconstruye, por medio de una combinación complicada entre estos osteoblastos y osteoclastos. Para los osteoclastos, se ha establecido bien una cascada de factores de transcripción y factores de desarrollo implicados en la evolución desde la células progenitoras hasta el osteoclasto funcional. Por el contrario, se sabe poco sobre la estructura de los osteoblastos.

Los osteoblastos proceden de células progenitoras mesenquimales diferenciadas (MPCs) . Durante la diferenciación para dar lugar a osteoblastos se sobre-regula la actividad de la fosfatasa alcalina ósea (BAP) . La formación ósea in vivo tiene lugar a través de dos mecanismos distintos durante el desarrollo embrionario: osificación endocondrial e intra-membranosa (figura 1) . Como se muestra en esta figura, el progenitor mesenquimal o los hemocitoblastos representan los puntos de partida para ambas formas de la formación ósea. Durante la osificación intra

membranosa, los huesos lisos tales como los del cráneo o clavícula, se forman directamente a partir de condensaciones de células mesenquimales. Durante la formación de los huesos largos, tales como los huesos de las extremidades, las condensaciones mesenquimales conducen primero a un intermedio cartilaginoso que es invadido durante el desarrollo adicional por parte de las células endoteliales, osteoclastos y células mesenquimales que se diferenciarán para dar lugar a osteoblastos y osteocitos (Nakashima and De Crombrugghe, 2003) .

Se conoce un número de enfermedades que están provocadas por una alteración del equilibrio de ajuste fino entre la resorción ósea y la formación ósea, en el que las enfermedades esqueléticas representan un número grande de pacientes: hipercalcemia de tumor maligno, enfermedad de Paget, enfermedades óseas inflamatorias tales como artritis reumática y enfermedad periodontal, osteogénesis localizada que tiene lugar durante las metástasis esqueléticas, síndrome de Crouzon, raquitismo, opsismodisplasia, picnodisostosis/enfermedad de Toluose-Lautrec, osteogénesis imperfecta y la enfermedad ósea individual más importante: osteoporosis.

Actualmente, la osteoporosis afecta a 1 de cada 5 mujeres de más de 50 años y a 1 de cada 2 hombres de más de 50 años. Para estos pacientes, está disponible un número de tratamientos, que en su mayoría abordan el aumento neto de la resorción ósea, es decir:

- terapia de sustitución hormonal (HRT)

- moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERMs) 45

- biofosfonatos

- calcitonina

Aunque estos tratamientos ralentizan la resorción ósea, no eliminan las fracturas porque no se sustituye el hueso perdido de manera suficiente. Las fracturas se detienen cuando la formación ósea aumenta en la medida suficiente. Por tanto, existe un gran interés en la identificación de mecanismos osteogénicos que conduzcan, por sí mismos, a la intervención terapéutica con anabolismo óseo como efecto. Actualmente, únicamente una terapia anabólica ósea ha alcanzado el mercado de la osteoporosis: la hormona paratiroide (PTH) 1-34. PTH muestra efectos anabólicos 55 óseos cuando se administra de forma intermitente. El tratamiento con PTH es, no obstante, muy problemático debido a que es necesario inyectar este biofármaco diariamente en el paciente. Además, se ha observado la formación de tumores cuando se tratan animales con dosis elevadas. También, es un tratamiento muy caro.

Se ha aprobado otra clase de anabólicos óseos, las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) , pero únicamente para mercados nicho, ya que existen desventajas en su uso como agentes terapéuticos para mejorar la consolidación ósea. Se han identificado receptores para las proteínas morfogenéticas óseas en muchos tejidos, y los propios BMPs se expresan en una gran variedad de tejidos con patrones espaciales y temporales específicos. Esto sugiere que BMPs pueden tener efectos sobre muchos tejidos diferentes del tejido óseo, limitando potencialmente su utilidad como agentes terapéuticos cuando se administran de forma sistémica.

Wkabayashi et al (2002. J. Bone Mineral Res, 17 (2) , 249-259) describe un ensayo en el que se ponen en contacto células de precursor osteogénico con inhibidores de PDEs y se mide su efecto sobre, entre otros, la inducción de ALP y BMP-4, marcadores de la diferenciación osteoblástica. Los autores concluyen que PDE2, PDE3 y PDE4 favorecen la diferenciación hacia un fenotipo osteoblástico y que los inhibidores selectivos sobre ellos pueden representar terapias para el tratamiento de enfermedades óseas metabólicas.

Por consiguiente, existe una continua necesidad de nuevas estrategias de tratamiento y compuestos (en particular anabólicos) que obvien uno o más de los inconvenientes de las estrategias de tratamiento actualmente disponibles.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a un método para identificar un compuesto que induce diferenciación de células de mamíferos no diferenciadas para dar lugar a osteoblastos, como se define en la reivindicación 1.

Descripción detallada Definiciones:

El término "vehículo" significa un material no tóxico usado en la formulación de composiciones farmacéuticas para proporcionar un medio, volumen y/o forma usable a una composición farmacéutica. Un vehículo puede comprender uno o más de los citados materiales tales como un excipiente, estabilizador o una disolución acuosa con pH tamponado. Ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen ingredientes de tampón acuosos o sólidos que incluyen fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; amino ácidos tales como glicina, glutamina,

asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contra iones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN. TM., polietilenglicol (PEG) , y PLURONICS.TM.

El término "compuesto" se usa en la presente memoria en el contexto de "compuesto de ensayo" o "compuesto candidato a fármaco" descrito en conexión con los ensayos de la presente invención. Como tal, estos compuestos comprenden compuestos orgánicos o inorgánicos, procedentes de fuentes sintéticas o naturales. Los compuestos incluyen compuestos inorgánicos u orgánicos tales como polinucleótidos, lípidos o análogos de hormonas que se caracterizan por pesos moleculares relativamente bajos. Otros compuestos de ensayo orgánicos biopoliméricos incluyen péptidos que comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 amino ácidos y polipéptidos de gran tamaño que comprenden de aproximadamente 40 a aproximadamente 500 amino ácidos, tales como anticuerpos o conjugados de anticuerpos.

El término "contacto" o la expresión "poner en contacto" significan juntar al menos dos restos, ya sea en un sistema in vitro o un sistema in vivo.

El término "trastorno" o "enfermedad" significa la presentación evidente de síntomas (es decir, enfermedad) o la manifestación de indicadores clínicos anormales (por ejemplo, indicadores bioquímicos) . Alternativamente, el término "enfermedad" se refiere a un riesgo genético o ambiental o propensión al desarrollo de dichos síntomas o 45 indicadores clínicos anormales.

El término "endógeno" significa un material que produce naturalmente un mamífero. Por el contrario, la expresión no endógeno en este contexto significa que no se produce de forma natural por un mamífero (por ejemplo, y sin limitación, un humano) o un virus.

El término "expresión" comprende tanto expresión endógena como sobre-expresión por medio de transducción.

La expresión "ácido nucleico expresable" significa un ácido nucleico que codifica para una molécula de proteína, una molécula... [Seguir leyendo]

1. Método para identificar un compuesto que induce diferenciación de células de mamíferos no diferenciadas para dar lugar a osteoblastos, que comprende: 5

(a) poner en contacto un compuesto con una fosfodiestearasa 11A, PDE11A, polipéptido, y

(b) medir una propiedad de compuesto-polipéptido relacionada con la diferenciación de dichas células; 10 en el que: i) dicho polipéptido es una preparación in vitro libre de células y dicha propiedad es una afinidad de enlace de dicho compuesto a dicho polipéptido, y

ii) dicha propiedad es la activación de un mecanismo biológico que produce un marcador bioquímico indicador de la diferenciación de dichas células.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho marcador biológico es fosfatasa alcalina ósea.

3. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que dicho compuesto está seleccionado entre el grupo que consiste en compuestos de una biblioteca de detección disponible comercialmente y compuestos que tienen afinidad de enlace por un polipéptido que comprende dicha secuencia de amino ácidos.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido es un péptido de una biblioteca de 25 muestra de bacteriófagos o una biblioteca de fragmentos de anticuerpos.