Método y uso de un aparato para análisis in vitro de células biológicas y/o microorganismos.

Un método para el análisis in vitro de células biológicas de individuos donantes,

que comprende las etapas de:

(a) proyectar radiación infrarroja sobre una muestra de células biológicas naturales, incluyendo dicha radiaciónuna cantidad seleccionada de longitudes de onda;

(b) registrar las características espectrales después de la interacción con dicha muestra;

(c) derivar un espectro de infrarrojos con transformada de Fourier (FT-IR) a partir de las característicasespectrales recogidas;

(d) generar la transformada de la primera derivada o múltiple del espectro FT-IR adecuada para el análisis enun ordenador;

(e) comparar dicha derivada con la derivada de un espectro FT-IR de referencia de las células biológicasnaturales determinado previamente;

(f) identificar desviaciones de dicha derivada a partir de dicha derivada de referencia;

(g) determinar si las células biológicas naturales de un tipo dado analizadas in vitro corresponden o no a lasdeterminadas previamente y por tanto son del mismo individuo donante en base a la presencia de dichasdesviaciones.

Método y uso de un aparato para análisis in vitro de células biológicas y/o microorganismos La presente invención se refiere en líneas generales a un método de espectroscopía de infrarrojos (IR) para análisis in vitro de características de células biológicas y microorganismos. Más particularmente, el método de la presente invención permite el análisis específico y rápido de individuos donantes. Además, la invención se refiere al uso de un aparato para análisis in vitro de células biológicas de individuos donantes. Además, la invención se refiere al uso de este método y dicho aparato en el campo de los trasplantes/injertos e ingeniería tisular, medicina clínica, industria farmacéutica, control de calidad y/o seguridad de fármacos.

En la pasada década la aplicación de diferentes técnicas médicas y no médicas ha avanzado enormemente en áreas de estudio clínico. Es bien sabido que la facilidad de un tratamiento médico depende en gran medida de la velocidad del diagnóstico. Por tanto, la sensibilidad y la naturaleza discriminatoria precisa de los métodos tempranos de diagnóstico son muy importantes en el tratamiento médico eficaz de los pacientes. El potencial de las técnicas de exploración y diagnóstico de enfermedades en entornos clínicos así como en el área médica relacionada con los trasplantes ya los han investigado diversos grupos de investigación. Se han aplicado varias de estas técnicas en los últimos años para estudiar diferentes objetos biológicos tales como fluidos biológicos y tejidos. Muchos de ellos están enfocados específicamente a identificar ciertas afecciones patológicas o a determinar, diferenciar y tipificar diferentes células biológicas o microorganismos.

Hasta ahora el método más convencional para controlar, identificar, tipificar, cuantificar, clasificar y controlar objetos biológicos tales como diferentes tipos de células biológicas y microorganismos así como materiales de partida y los productos acabados usados, por ejemplo, en la medicina de los trasplantes es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Para un método emergente de identificación basado en genes, se aplican cebadores de PCR o sondas nucleotídicas específicos de género o específicos de especie a un objeto de interés. Sin embargo, existen algunas limitaciones al uso de PCR tales como (i) mayor coste que una PCR inicial ya se usa mucho más de dos veces la cantidad de enzima y reactivos, (ii) no puede programarse manipulaciones adicionales ni la duración del ensayo como bloques de ciclado para todos los ciclos desde el inicio, (iii) sirve solamente para cortos fragmentos de ADN. Además, dichas determinaciones llevan mucho tiempo y requieren aparatos sofisticados para realizar los diferentes ensayos.

Un concepto muy común adicional es el uso de marcadores específicos de tipo celular. A este respecto, es muy difícil encontrar marcadores específicos de tipo celular dirigidos solamente a un tipo celular específico. Este concepto tiene el problema de que solamente pueden determinarse cantidades en la expresión pero no se da una respuesta a si está presente un tipo de célula diferente o no.

Otros métodos convencionales para interpretar sistemas biológicos, en particular células o microorganismos, son por ejemplo técnicas fluorescentes y quimioluminiscentes de formación de imágenes así como espectroscopía de RMN:

(i) Los métodos fluorescentes y quimioluminiscentes de formación de imágenes requieren el marcaje de un componente por un marcador y habitualmente detectan solamente la concentración de la molécula marcadora.

(ii) Aunque la espectroscopía de RMN en solución proporciona una imagen detallada de la estructura de un bio

objeto, el método de RMN es mucho más complejo. Además, para los análisis de RMN se necesitan grandes cantidades de las muestras que tienen que marcarse adicionalmente mediante isótopos de carbono (13C) , nitrógeno (15N) , oxígeno (170) , e hidrógeno (2H) .

La espectroscopía de infrarrojos (IR) es una técnica usada rutinariamente por químicos, bioquímicos, y científicos de materiales como método de análisis convencional. Las señales espectroscópicas observadas se deben a la absorción de la radiación infrarroja que es específica para grupos funcionales de la molécula. Estas frecuencias de absorción están asociadas con los movimientos de vibración de los núcleos de un grupo funcional y muestran distintos cambios cuando se modifica el entorno químico del grupo funcional. La espectroscopía de infrarrojos proporciona esencialmente una huella molecular y por tanto siempre tiene potencial como herramienta de 55 diagnóstico y control en biología y medicina. Los espectros de infrarrojos contienen abundante información sobre la molécula, en particular se usan para la identificación y cuantificación de especies moleculares, las interacciones entre moléculas adyacentes, su estado de hidratación, su forma global, etc. Los espectros infrarrojos pueden usarse como marcador sensible de cambios estructurales de células y de la reorganización que sucede en células. El potencial diagnóstico de la espectroscopía de infrarrojos se está manifestando en muchos programas de investigación médica basados en la premisa fundamental de que en cualquier proceso patológico, el cambio químico debe preceder a la manifestación morfológica o sintomática. Las aplicaciones orgánicas de la espectroscopía IR afectan casi completamente a las frecuencias en el intervalo de 400-4000 cm-1 (infrarrojo medio) . Frecuencias inferiores a 400 cm-1 se llaman infrarrojo lejano y aquellas mayores de 4000 cm-1 se llaman infrarrojo cercano.

Por tanto, existen varias ventajas importantes en el uso de esta técnica: se obtienen resultados de forma relativamente rápida con menos trabajo que muchas otras técnicas. El uso de espectroscopía IR puede proporcionar información más precisa sobre la naturaleza exacta de, por ejemplo, una enfermedad en base al muestreo de un fluido biológico o tejido. El método también permite controlar la dinámica del cambio característico, que es importante en la determinación de la fase exacta de un objeto biológico, tal como células o microorganismos, o de una enfermedad.

Erukhimovitch et al. (Photochemistr y and Photobiology, 2002, 76 (4) , 446-451) desvelan un método para el diagnóstico y caracterización de patologías celulares y tisulares. En particular, Erukhimovitch et al. desvelan el uso de microespectroscopía de infrarrojos con transformada de Fourier (FT-IR) en lugar de espectroscopía FT-IR convencional ya que tiene ventajas en el diagnóstico de neoplasias. Para este fin se comparan microespectros FT-IR

de dos tipos de células malignas transformadas con retrovirus con aquellos de células primarias no transformadas y con aquellos de dos tipos de líneas celulares. Erukhimovitch et al. sugieren el uso de, por ejemplo, una banda correspondiente al modo de extensión simétrica de PO2-para controlar los niveles de fosfato y otros metabolitos. Erukhimovitch et al. desvelan el uso de microespectroscopía FT-IR para la investigación del metabolismo en células de ratones y humanas comparando los microespectros FT-IR de dos tipos de células malignas transformadas con retrovirus con aquellos de células primarias no transformadas y con aquellos de dos tipos de líneas celulares. Por tanto, Erukhimovitch et al. se refieren al estudio del metabolismo de células que puede considerarse como una imagen instantánea del estado de la célula y puede usarse adicionalmente para la clasificación de la actividad metabólica de la célula y el estado metabólico de la célula.

Sin embargo, el problema principal en la microespectroscopía FT-IR es la presencia de luz dispersada debido a la difracción que limita la resolución espacial aumentando el ruido. La difracción es significativa cuando las dimensiones de apertura se acercan a la longitud de onda de la radiación IR. El efecto principal de la difracción es que a pequeños tamaños de apertura, la luz se propaga fuera del área especificada en la región adyacente. Cuando se busca una mayor resolución espacial, el problema aumenta, ya que las aperturas son más pequeñas, lo que conduce finalmente a la pérdida de la calidad espectral y la precisión fotométrica. Por lo tanto, el espectro obtenido no siempre corresponde exactamente al área que se observa visualmente y está definida por la apertura remota. Esto es especialmente cierto cuando las dimensiones de la muestra son muy pequeñas. Además, siempre que se hacen mediciones cuando el tamaño de la muestra que se está observando es igual a, o ligeramente mayor que, el límite de difracción, se transmite algo de radiación al detector desde fuera de la región... [Seguir leyendo]

1. Un método para el análisis in vitro de células biológicas de individuos donantes, que comprende las etapas de:

(a) proyectar radiación infrarroja sobre una muestra de células biológicas naturales, incluyendo dicha radiación una cantidad seleccionada de longitudes de onda;

(b) registrar las características espectrales después de la interacción con dicha muestra;

(c) derivar un espectro de infrarrojos con transformada de Fourier (FT-IR) a partir de las características espectrales recogidas;

(d) generar la transformada de la primera derivada o múltiple del espectro FT-IR adecuada para el análisis en un ordenador;

(e) comparar dicha derivada con la derivada de un espectro FT-IR de referencia de las células biológicas naturales determinado previamente;

(f) identificar desviaciones de dicha derivada a partir de dicha derivada de referencia;

(g) determinar si las células biológicas naturales de un tipo dado analizadas in vitro corresponden o no a las determinadas previamente y por tanto son del mismo individuo donante en base a la presencia de dichas desviaciones.

2. El método de la reivindicación 1, donde la derivada múltiple es una segunda derivada. 20

3. El método de la reivindicación 1 o 2, donde las desviaciones surgen de la diferencia estructural de las muestras.

4. El método de las reivindicaciones 1 a 3 que incluye adicionalmente una etapa de determinar qué condiciones de

medio se aplicaron a las células biológicas en base a dichas desviaciones. 25

5. El método de las reivindicaciones 1 a 4, donde las longitudes de onda seleccionadas incluyen el intervalo de 4000 cm-1 a 400 cm-1.

6. El método de las reivindicaciones 1 a 5, donde las longitudes de onda seleccionadas incluyen el intervalo de 1500 30 cm-1 a 700 cm-1.

7. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, donde las células biológicas son células de mamífero, preferiblemente células humanas seleccionadas entre el grupo que consiste en células sanguíneas, células inmunes, células del sistema endocrino, células del sistema nervioso, células del sistema respiratorio, células del sistema circulatorio, células del sistema digestivo, células del cartílago, células óseas y musculares, células cutáneas y capilares, células musculares, células del sistema urinario así como células del sistema reproductor.

8. El método de las reivindicaciones 1 a 7, donde los espectros de referencia para la comparación en la etapa (e) se preparan partiendo de cultivos puros del tipo celular de interés y/o cultivos mixtos conocidos del tipo celular de 40 interés con uno o más tipos celulares adicionales.

9. El método de las reivindicaciones 1 a 8, donde la radiación infrarroja interacciona con la muestra, y la radiación característicamente alterada se detecta en uno de una configuración de transmisión/absorción o reflexión total atenuada.

10. Uso de un aparato para el análisis in vitro de células biológicas de individuos donantes, comprendiendo dicho aparato:

(a) un dispositivo que recibe la muestra para una suspensión de células biológicas y/o microorganismos;

(b) un medio para irradiar una muestra de células biológicas naturales con luz infrarroja y un medio para registrar el espectro de absorción obtenido;

(c) un medio para realizar una transformada de Fourier del espectro de absorción obtenido en un espectro FT-IR;

(d) un medio para calcular la primera y, opcionalmente, las derivadas múltiples del espectro FT-IR; y

(e) un medio para comparar la derivada o derivadas de la etapa (d) en un intervalo de número de onda preseleccionado con la misma derivada o derivadas de los espectros FT-IR de referencia de las células biológicas naturales preparados previamente y almacenadas en el aparato.

11. Uso del método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9 para el control de calidad farmacéutica y la seguridad 60 de fármacos de células biológicas.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 para controlar los cambios en tipos o características celulares en el tiempo.

13. Uso del método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9 para el diagnóstico de diversas enfermedades.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, donde las diversas enfermedades son enfermedades seleccionadas entre el grupo que consiste en infección vírica o bacteriana, enfermedades por priones, diabetes y cáncer.

15. Uso del método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9 para analizar la pureza de células biológicas usadas en un trasplante/injerto.