Método y sistemas para el enriquecimiento uniforme de regiones genómicas.

Un método para el enriquecimiento uniforme de una población de moléculas de ácido nucleico en una muestra,

que comprende:

a) proporcionar una muestra de moléculas de ácido nucleico que comprende una pluralidad de secuencias de ácidonucleico diana,

b) hibridar la muestra a un soporte que comprende sondas de ácido nucleico inmovilizadas bajo condiciones quesoportan la hibridación entre las sondas de ácido nucleico inmovilizadas y la pluralidad de secuencias de ácidonucleico diana, en el que dichas sondas de ácido nucleico inmovilizadas son complementarias de dicha pluralidad desecuencias de ácido nucleico diana, en el que la densidad de dichas sondas de ácido nucleico inmovilizadas paraproducir de forma óptima una profundidad de lectura uniforme se predice utilizando un modelo de regresión linealcon ajustes empírico, que ajusta la profundidad de lectura a la densidad de las sondas de ácido nucleicoinmovilizadas, y en el que las sondas de ácido nucleico inmovilizadas proporcionan una hibridación uniforme entredicha pluralidad de secuencias de ácido nucleico diana, y

c) separar las secuencias de ácido nucleico no hibridadas de las secuencias de ácido nucleico diana hibridadas,enriqueciendo así de forma uniforme una población de moléculas de ácido nucleico en una muestra.

Métodos y sistemas para el enriquecimiento uniforme de regiones genómicas Campo de la invención La presente invención proporciona métodos y composiciones para el enriquecimiento de ácidos nucleicos diana en un sistema de microchips. En particular, la presente invención proporciona métodos y composiciones para el enriquecimiento uniforme de moléculas de ácido nucleico diana en un formato de microchips. La presente descripción también proporciona métodos para el enriquecimiento intencionado no uniforme entre moléculas de ácido nucleico diana.

Antecedentes de la invención La llegada de la tecnología de microchips de ácido nucleico hace posible la construcción de un chip de millones de secuencias de ácido nucleico en un área muy pequeña, por ejemplo en un portaobjetos de microscopio (por ejemplo, US 6.375.903 y US 5.143.854) . En un principio, estos chips se crearon mediante la dispersión de secuencias de DNA presintetizadas en un portaobjetos. Sin embargo, la construcción de sintetizadores de microchips sin máscara (MAS) como se describe en US 6.375.903 permite ahora la síntesis in situ de secuencias de oligonucleótidos directamente sobre el portaobjetos.

En la utilización de un instrumento MAS, la selección de las secuencias de oligonucleótidos que se construirán en el microchip se encuentra bajo el control de un programa informático de tal manera que ahora es posible crear chips personalizados individualmente según las necesidades particulares de un investigador. En general, la tecnología de síntesis de microchips de oligonucleótido basada en MAS permite la síntesis en paralelo de más de 4 millones de oligonucleótidos con características únicas en un área muy pequeña de un portaobjetos de microscopio estándar. Con la disponibilidad de los genomas completos de cientos de organismos, para los que por lo general se ha depositado una secuencia de referencia en una base de datos pública, se han utilizado los microchips para realizar el análisis de secuencias sobre los ácidos nucleicos aislados de una gran variedad de organismos.

La tecnología de microchips de ácidos nucleicos se ha aplicado a muchas áreas de investigación y de diagnóstico, tales como la expresión y el descubrimiento de genes, detección de mutaciones, comparación de la secuencia evolutiva y alélica, mapeado del genoma, descubrimiento de fármacos, y más. Muchas aplicaciones requieren la búsqueda de variantes genéticas y mutaciones a lo largo de todo el genoma humano; variantes y mutaciones que, por ejemplo, pueden ser la base de enfermedades humanas. En el caso de enfermedades complejas, estas búsquedas generalmente resultan en un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) o un conjunto de SNP asociados con una o más enfermedades. La identificación de tales SNP ha demostrado ser una ardua tarea que consume tiempo y dinero en la que se requiere con frecuencia la resecuenciación de grandes regiones de DNA genómico, por lo general mayor de 100 kilobases (Kb) de individuos afectados y / o muestras de tejido para encontrar un solo cambio de base o identificar todas las variantes de la secuencia.

El genoma es normalmente demasiado complejo para ser estudiado como un todo, y las técnicas deben utilizarse para reducir la complejidad del genoma. Para abordar este problema, una solución consiste en reducir ciertos tipos de secuencias abundantes a partir de una muestra de DNA, tal como se encuentra en US 6.013.440. Las alternativas utilizan métodos y composiciones para el enriquecimiento de las secuencias genómicas como se describe, por ejemplo, en Albert, TJ, et al., Nat. Meth., 4 (2007) 903-5, y Okou, DT, et al., Nat. Meth. 4 (11) (2007) 907-9. Albert et al. describe una alternativa que es coste efectiva y rápida en la reducción efectiva de la complejidad de una muestra genómica de una manera definida por el usuario para permitir procesamientos y análisis adicionales.

Sin embargo, es igualmente importante ser capaz de enriquecer secuencias diana de manera uniforme sobre las regiones diana. Si el enriquecimiento no es uniforme, por ejemplo, algunas secuencias diana se capturarán de manera desproporcionada en comparación con otras secuencias diana, negando así las aplicaciones posteriores que dependen de la distribución aproximadamente uniforme de las secuencias diana. Hodges, E., et al., Nature Genetics 39 (12) (2007) 1522-7 observó que un parámetro crítico en la captura del microchip fue la introducción de la captura de la diana sesgada que afecta en gran medida la profundidad de cobertura de la secuencia. Sin embargo, Hodges no ofreció una alternativa a seguir, aparte de decir que la redistribución de la sonda para compensar la captura sesgada necesariamente introducirá otros tipos de sesgos que conllevarán problemas con aplicaciones posteriores, como por ejemplo las aplicaciones de secuenciación.

Como tal, lo que se necesita son métodos y composiciones para proporcionar la captura uniforme, y por lo tanto la representación de las dianas capturadas durante la captura y el enriquecimiento de secuencias diana en un formato de microchip. A la inversa, un investigador podría también requerir una no-uniformidad de captura a propósito, por ejemplo si un investigador prevé buscar exones sobre las regiones intergénicas. Tales métodos proporcionarán una utilidad de datos máxima a los investigadores en sus esfuerzos por identificar y comprender, por ejemplo, las causas de la enfermedad y los tratamientos terapéuticos asociados.

Resumen de la invención La presente invención proporciona métodos para el enriquecimiento de ácidos nucleicos diana en un sistema de microchips. En particular, la presente invención proporciona métodos para el enriquecimiento uniforme de moléculas de ácido nucleico diana en un formato de microchips. La presente descripción también proporciona métodos para el enriquecimiento intencionado no uniforme entre moléculas de ácido nucleico diana.

El enriquecimiento del ácido nucleico reduce la complejidad de una muestra grande de ácido nucleico, tal como una muestra de DNA genómico, biblioteca de cDNA o biblioteca de mRNA, para facilitar su posterior procesamiento y análisis genético. Los métodos preexistentes de captura de ácidos nucleicos utilizan sondas de ácido nucleico inmovilizadas para capturar secuencias de ácido nucleico diana (por ejemplo, como las encontradas en el DNA genómico, DNAc, RNAm, etc) mediante la hibridación de la muestra a sondas inmovilizadas sobre un soporte sólido. Los ácidos nucleicos diana capturados, como los encontrados por ejemplo en el DNA genómico, se lavan y se eluyen de las sondas inmovilizadas en el soporte sólido. Las secuencias genómicas eluídas son más susceptibles para el análisis genético detallado que una muestra genómica que no se ha sometido a este procedimiento. El enriquecimiento de las secuencias de ácido nucleico diana lleva la captura de ácidos nucleicos un paso más allá, al reducir la complejidad de una muestra en la que las secuencias de interés se seleccionan por, o se enriquecen, mediante procesos selectivos. Los métodos de enriquecimiento y las composiciones se describen completamente en la solicitud de patente US Números 11/789.135 y 11 / 970.949 y de la Solicitud de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual número PCT/US07/010064.

El enriquecimiento de ácidos nucleicos diana en un formato de microchip es importante para la reducción de la complejidad de una muestra de ácido nucleico antes de, por ejemplo, la secuenciación u otras aplicaciones posteriores. Sin embargo, muchas aplicaciones posteriores dependen fuertemente de la lectura de secuencias resultantes que tiene una distribución aproximadamente uniforme en las regiones diana, como representación desproporcionadamente alta de algunas dianas que necesariamente agota las demás. Aunque el enriquecimiento basado en chips enriquece fuertemente fragmentos específicos, se contempla que ciertas dianas están más fuertemente enriquecidas que otras produciendo de ese modo la dianas o capturas sesgadas.

Como tal, la presente invención proporciona métodos para abordar esta captura sesgada de ácidos nucleicos diana. Por ejemplo, las realizaciones de la presente invención proporcionan para el diseño de los chips que se modifican para redistribuir sondas de las dianas con enriquecimiento superior a la media para aquellas que tienen enriquecimiento por debajo de la media. En el desarrollo de formas de realización de la presente invención, se determinó que esta redistribución de las sondas mejora de manera significativa la uniformidad de enriquecimiento entre las dianas capturadas. Por el contrario, la presente descripción también proporciona para el diseño del chip que se modifica para redistribuir sondas que introducen... [Seguir leyendo]

1. Un método para el enriquecimiento uniforme de una población de moléculas de ácido nucleico en una muestra, que comprende:

a) proporcionar una muestra de moléculas de ácido nucleico que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico diana,

b) hibridar la muestra a un soporte que comprende sondas de ácido nucleico inmovilizadas bajo condiciones que soportan la hibridación entre las sondas de ácido nucleico inmovilizadas y la pluralidad de secuencias de ácido nucleico diana, en el que dichas sondas de ácido nucleico inmovilizadas son complementarias de dicha pluralidad de secuencias de ácido nucleico diana, en el que la densidad de dichas sondas de ácido nucleico inmovilizadas para producir de forma óptima una profundidad de lectura uniforme se predice utilizando un modelo de regresión lineal con ajustes empírico, que ajusta la profundidad de lectura a la densidad de las sondas de ácido nucleico inmovilizadas, y en el que las sondas de ácido nucleico inmovilizadas proporcionan una hibridación uniforme entre dicha pluralidad de secuencias de ácido nucleico diana, y

c) separar las secuencias de ácido nucleico no hibridadas de las secuencias de ácido nucleico diana hibridadas, enriqueciendo así de forma uniforme una población de moléculas de ácido nucleico en una muestra.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha separación comprende el lavado de dicho soporte.

3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, que además comprende la fragmentación de dicha muestra de moléculas de ácido nucleico previamente a dicha hibridación.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, que además comprende la ligación de una molécula adaptadora en uno o ambos extremos de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico fragmentadas previamente a dicha hibridación.

5. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, que además comprende la desnaturalización de dicha muestra de moléculas de ácido nucleico previamente a dicha hibridación.

6. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, que además comprende la elución del soporte de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico diana hibridadas.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, que además comprende la secuenciación de las secuencias de ácido nucleico diana eluidas.

8. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, en el que dicho soporte es un portaobjetos para microchips.

9. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, en el que dicho soporte es una cuenta.

10. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-9, en el que dicha población de moléculas de ácido nucleico es una población de moléculas de DNA genómico.

11. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-9, en el que dicha población de moléculas de ácido nucleico es una población de moléculas de DNA genómico amplificadas.

Puntuación de cobertura no uniforme (DE de la cobertura media por locus)