MÉTODO Y KIT PARA LA IDENTIFICACIÓN VARIETAL DEL ORIGEN DEL POLEN DE OLIVO.

Método y kit para la identificación varietal del origen del polen de olivo.

La presente invención se refiere a un método para la identificación del origen varietal del polen del olivo basado en marcadores Simple Sequences Repeats o Repeticiones de Secuencias Simples (SSRs) así como a un kit que comprende los elementos necesarios, preferiblemente cebadores específicos para la amplificación de los marcadores, para llevar a cabo dicho método.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201130568.

Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: ALCHE RAMIREZ,JUAN DE DIOS, RODRIGUEZ GARCIA,MARIA ISABEL, MAHDI,Fendri.

Fecha de Publicación: 27 de Mayo de 2013.

Clasificación Internacional de Patentes:

C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2404342_A1.pdf

Fragmento de la descripción:

Método y kit para la identificación varietal del origen del polen de olivo.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biotecnología. Específicamente, se refiere a un método para la identificación del origen varietal del polen del olivo basado en marcadores SSRs así como a un kit que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo dicho método.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La identificación varietal de las plantas es uno de los elementos más importantes en la agricultura, ya que la variedad vegetal puede determinar por ejemplo las características agronómicas de una planta. Esto es importante para que el agricultor decida cual es la variedad más interesante para cultivar, bien por las características del terreno donde se va a llevar a cabo la siembra, o bien por la necesidad de un tipo de producto determinado que llevar al mercado.

La determinación varietal, en la actualidad se lleva a cabo mediante la obtención de tejidos diploides del vegetal, y analizando su genoma.

La identificación del origen del polen resulta interesante en múltiples campos como por ejemplo el de la aeropalinología, y fundamentalmente en las alergias, ya que las personas alérgicas pueden reaccionar de forma diferente al polen proveniente no solo de diferentes especies vegetales, sino también de distintas variedades dentro de una especie (Bousquet et al. 1985, Clín Allergy., 14: 249-258; Castro et al. 2003, lnt. Arch. Allergy Clín. lmmunol., 131 :164-173) . Diversos estudios han demostrado que la reactividad de sueros procedentes de diferentes pacientes es variable en función del origen varietal del polen al que se expongan. En la actualidad existen muchos métodos de muestreo que permiten captar el polen para por ejemplo determinar la composición del aire (Mandrioli et al. 1998, Methods in Aerobíology. 47-68) . Este polen captado se analiza a nivel de especie y permite la realización de calendarios polínicos que detallan las concentraciones de los taxones de pólenes en una determinada localidad. La identificación del origen varietal de dichos pólenes se convertiría en una herramienta adicional que permitiría la mejora de los calendarios polínicos además de permitir una mejor determinación del riesgo alérgico.

Por otro lado, dentro de la medicina también resultaría interesante la determinación del origen varietal del polen, ya que permitiría por ejemplo llevar a cabo la certificación del polen utilizado en la preparación de las vacunas o kits de diagnóstico ya que permiten una mejor identificación del mismo lo que proporcionaría una mayor seguridad y una mayor eficacia para el paciente.

Además de en medicina, la identificación del polen sería útil en otras áreas como por ejemplo en los bancos de germoplasma, donde su identificación es relevante a la hora de llevar a cabo la administración del polen con un origen varietal certificado para la mejora de especies (Stephan Mercier 1995, Grana.

6: 367-370) .

Otra aplicación interesante de la determinación varietal de un vegetal se da a la hora de llevar a cabo el análisis de la propagación de genes a partir de plantas transgénicas. Los organismos transgénicos se pueden difundir en la naturaleza a través, fundamentalmente, de la polinización cruzada. Esto puede afectar a la biodiversidad además de modificar poblaciones genéticamente compatibles de plantas silvestres presentes alrededor del cultivo (Lefol et al. 1996, Sex Plant Reprod. 9: 189-196; Ellstrand et al. 1999, Annu Rev Eco/ Syst., 30: 539-563) . En la actualidad el método para determinar el porcentaje de polinización cruzada ocurrida en plantas transgénicas consiste en la recolección y germinación de semillas. La capacidad de identificar el polen de la progenie permitiría determinar la tasa de flujo de genes entre diferentes especies y/o variedades. El disponer de un método para llevar a cabo la identificación del origen varietal del polen, permitiría determinar el grado de dispersión del polen transgénico tras la recolección de muestras.

Cabe destacar también que los métodos actualmente disponibles para caracterizar el origen varietal de diversas especies sólo se aplican actualmente a material diploide Gokirmak et al. 2009, Genet Resour Crop Evo/., 56:147-172, por lo que no se está realizando el análisis del polen utilizado comercialmente, por ejemplo, para la polinización artificial de especies. Debido a la autoincompatibilidad existente entre algunas variedades vegetales, por ejemplo del olivo, se hace necesaria una variedad polinizadora. Esto hace que exista por tanto, una necesidad tanto por parte de las empresas suministradoras como por parte de los agricultores de conseguir un método que permita la certificación del origen varietal para que el agricultor pueda determinar cual es el más acorde con sus necesidades.

La determinación del origen vegetal del polen se ha encontrado con diversas dificultades como por ejemplo la dotación genética haploide del polen que no permite disponer de toda la información genética de la planta madre, o como la necesidad de un método diferente para el análisis del polen en función de la especie vegetal de la que se trate, ya que el polen presenta diferencias importantes a nivel morfológico, estructural y genético que hacen que cada método haya de ser adaptado en función de la especie que se quiera analizar.

Por todo lo descrito anteriormente, se hace necesaria la búsqueda de un sistema que permita la rápida identificación del polen, ya que esto permitiría superar muchas de las barreras existentes en la actualidad para la determinación de la variedad vegetal únicamente mediante el uso de tejidos diploides. Este método presentaría multitud de aplicaciones de utilidad tanto en aspectos agronómicos como médicos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para la identificación del origen varietal del polen de olivo mediante el uso de marcadores SSRs (Simple Sequences Repeats o repeticiones de secuencias simples) , así como a un kit que comprende los medios necesarios, preferiblemente cebadores específicos para los SSRs, para llevar a cabo dicho método.

En la presente invención se demuestra, mediante el uso de muestras ciegas que el método de la invención permite la identificación de la variedad vegetal de la que proceden diversos pólenes de olivo. Esta identificación se realiza mediante la amplificación de marcadores SSRs. Estos marcadores presentan un elevado polimorfismo inter e intraespecífico. Además su segregación es codominante por lo que la contribución de ambos alelas es detectable en las muestras. Estas características contribuyen a que estos marcadores presenten una serie de ventajas frente a otros marcadores utilizados previamente como son una alta reproducibilidad, una elevada facilidad de detección, o un gran poder discriminativo. Además, presentan como ventaja adicional la segregación independiente, lo que los convierte en unos marcadores ideales para la determinación del origen varietal del olivo.

El método descrito en la presente invención presenta además como particularidad que es llevado a cabo a partir de muestras de polen de olivo. Esto supone una mejora frente a lo previamente descrito, ya que los granos de polen presentan una dotación genética haploide, lo que hace que presenten una información genética incompleta de la planta madre. Sin embargo, en una población de polen, todas las posibilidades de segregación están representadas, y por tanto una población suficiente de polen comprendería la información genética completa de la planta madre. El polen no ha sido usado con anterioridad fundamentalmente debido a la relativa complejidad de la extracción de su material genético frente a otros tejidos, a la baja cantidad obtenible a partir de polen con respecto por ejemplo a hojas, y a la necesidad de una población suficiente para disponer de la dotación genética completa de la planta madre.

El uso de polen para la identificación presenta como ventaja adicional, además, la no necesidad de dañar el vegetal para obtener tejido para la identificación varietal, ya que este polen se desprende naturalmente de la planta.

Cabe indicar que los métodos a llevar a cabo en granos de polen, han de ser adecuados a cada una de las especies en que se realicen debido fundamentalmente a las diferencias tanto morfológicas como bioquímicas del polen perteneciente a diferentes especies. Estas diferencias son tanto más acusadas cuanto más alejadas evolutivamente se encuentran las especies.

La identificación varietal del polen de olivo, debido a la importancia de este elemento en la agricultura, a nivel ambiental o en medicina presenta... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Método de identificación del origen varietal del polen de olivo que

comprende: a) Obtener una muestra de polen de olivo, b) extraer el DNA de la muestra obtenida en (a) , e) amplificar marcadores SSRs en el DNA obtenido en (b) , d) analizar el perfil alélico de los SSRs amplificados en (e) para obtener el genotipo, e) comparar el genotipo del paso (d) con genotipos de variedades vegetales conocidas, y f) determinar la variedad vegetal en base a la comparación de (e) .

2. Método según la reivindicación 1 donde la cantidad de DNA extraído en el paso (b) es de al menos 50 ng.

3. Método según la reivindicación 2 donde la cantidad de DNA extraído en el paso (b) es de al menos 200 ng.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde los marcadores SSRs amplificados en el paso (e) son al menos 3.

5. Método según la reivindicación 4 donde los marcadores SSRs amplificados en el paso (e) son al menos 6.

6. Método según la reivindicación 5 donde los marcadores SSRs amplificados en el paso (e) son al menos 1 O.

7. Método según la reivindicación 6 donde los marcadores SSRs amplificados son 1 O.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde los marcadores SSRs amplificados en el paso (e) se seleccionan de la lista

que comprende ssrOeUA-DCA3; ssrOeUA-DCA9, ssrOeUA-DCA16, ssrOeUA-DCA 18, GAPU71 B, GAPU59, GAPU1 01, GAPU1 03A, UD099-24 y UD099-43.

9. Kit de identificación del origen varietal del polen de olivo que comprende cebadores específicos para llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

1O. Kit de identificación del origen varietal del polen de olivo que comprende cebadores específicos para al menos 3 de los marcadores de la lista que comprende ssrOeUA-DCA3; ssrOeUA-DCA9, ssrOeUA-DCA 16, ssrOeUA-DCA 18, GAPU71 B, GAPU59, GAPU1 01, GAPU1 03A, UD099-24 y UD099-43.

11. Kit de identificación del origen varietal del polen de olivo según la reivindicación 1 Oque comprende cebadores específicos para al menos 6 de los marcadores ssrOeUA-DCA3; ssrOeUA-DCA9, ssrOeUA-DCA 16, ssrOeUA-DCA 18, GAPU71 B, GAPU59, GAPU1 01, GAPU1 03A, UD099-24 y UD099-43.

12. Kit de identificación del origen varietal del polen de olivo según la reivindicación 11 que comprende cebadores específicos para los marcadores ssrOeUA-DCA3; ssrOeUA-DCA9, ssrOeUA-DCA 16, ssrOeUA-DCA 18, GAPU71 B, GAPU59, GAPU1 01, GAPU1 03A, UD099-24 y UD099-43.

13. Kit de identificación del origen varietal del polen de olivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 O a 12 que comprende al menos 3 parejas de cebadores seleccionadas de la lista que comprende SEQ ID N0:11-SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13-SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15-SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17-SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19-SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21-SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23-SEQ ID N0:24,

SEQ ID N0:25-SEQ ID N0:26, SEQ ID N0:27-SEQ ID N0:28 y SEQ ID N0:29-SEQ ID N0:30.

14. Kit de identificación del origen varietal del polen de olivo según la reivindicación 13 que comprende al menos 6 parejas de cebadores seleccionadas de la lista que comprende SEQ ID N0:11-SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13-SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15-SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17-SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19-SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21-SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23-SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25-SEQ ID

N0:26, SEQ ID N0:27-SEQ ID N0:28 y SEQ ID N0:29-SEQ ID N0:30.

15. Kit de identificación del origen varietal del polen de olivo según la reivindicación 14 que comprende las parejas de cebadores SEQ ID N0:11-SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13-SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15-

SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17-SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19-SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21-SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23-SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25-SEQ ID N0:26, SEQ ID N0:27-SEQ ID N0:28 y SEQ ID N0:29-SEQ ID N0:30.

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