Método para sintetizar cadena de ADN.

Un método de reacción de extensión de cebadores para la amplificación de ADN independiente de la estructuraque comprende

- preparar una mezcla de reacción que contiene la muestra de ADN,

cebadores, una o múltiples enzimas capaces desintetizar una cadena de ácido nucleico complementaria de la cadena de ácido nucleico original, como una mezclade ADN polimerasa termoestable de dNTP y un tampón,

- desnaturalizar el ADN en una etapa de desnaturalización,

- alinear los cebadores en una etapa de alineamiento,

- extender los cebadores alineados en una etapa de extensión para obtener ADN amplificado,

caracterizado porque en la etapa de extensión, la temperatura primero se eleva de la temperatura de alineamiento ala primer temperatura de extensión en el intervalo de 70-90 °C, luego fluctúa hasta la segunda temperatura deextensión mayor en el intervalo de 75-95 °C y vuelve a la primera temperatura de extensión menor para unapluralidad de ciclos para desestabilizar las estructuras secundarias en el ADN para permitir la extensión.

Método para sintetizar cadena de ADN

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método de reacción de extensión de cebadores. Más en particular, la presente invención se refiere a un método de reacción de extensión de cebadores como un método de reacción en cadena de polimerasa, capaz de una amplificación independiente de la estructura de ADN difícil de amplificar con alto contenido de nucleótidos de citosina y guanosina, secuencias repetitivas y que forma fuertes estructuras secundarias. La presente invención también se refiere a métodos para diagnosticar trastornos tales como distrofia miotónica de tipo 1, síndrome de X frágil y EPM1 por reacción en cadena de polimerasa. La presente invención también se refiere a un termociclador programado para realizar el método de la invención.

Antecedentes de la invención La reacción en cadena de polimerasa, PCR, se ha usado por más de dos décadas para crear múltiples copias de un segmento de la plantilla original de ADN, y nuevas aplicaciones y modificaciones surgen a diario.

Por ejemplo, el documento US 4 683 202 es uno de los primeros documentos de patente en revelar el método de PCR. Describe un proceso para amplificar al menos una secuencia de ácidos nucleicos específica contenida en un ácido nucleico o una mezcla de ácidos nucleicos, en donde cada ácido nucleico consiste en dos cadenas complementarias separadas, de un tamaño igual o diferente, proceso que comprende: (a) tratar las cadenas con dos cebadores de oligonucleótido, amplificando cada secuencia específica diferente, en condiciones tales que, para cada secuencia diferente que se esté amplificando, se sintetice un producto de extensión de cada cebador que es complementario a cada cadena de ácido nucleico, en donde dichos cebadores se seleccionan de modo de ser suficientemente complementarios de distintas cadenas de cada secuencia específica para hibridarse con ellas, de modo que el producto de extensión sintetizado de un cebador, cuando se separa de su complemento, pueda servir como plantilla para la síntesis del producto de extensión del otro cebador; (b) separar los productos de extensión de cebadores de las plantillas en las que se sintetizaron para producir moléculas monocatenarias; y (c) tratar las moléculas monocatenarias generadas de la etapa (b) con los cebadores de la etapa (a) en condiciones tales que se sintetice un producto de extensión de cebadores usando cada una de las cadenas individuales producidas en la etapa (b) como una plantilla. Desde entonces se siguió desarrollando el método, por ejemplo, también como se describe en los documentos US 4 800 159 y US 4 965 188, pero el principio básico es bien conocido por un experto en la técnica.

También los termocicladores para llevar a cabo los métodos de PCR son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el documento US 5 038 852 revela un dispositivo básico de PCR que comprende un recipiente conductor de calor para mantener una mezcla de reacción, medios para calentar, enfriar y mantener dicho recipiente a una o una pluralidad de temperaturas predeterminadas (definidas por el usuario) y que tiene una entrada para recibir una señal de control que controla dichas temperaturas predeterminadas a las que se calienta, se enfría o se mantiene dicho recipiente; y un medio informático, acoplado con la entrada de dicho medio para calentar y enfriar, para generar las señales de control apropiadas para controlar los niveles de temperatura, las rampas de tasa de cambio de temperatura y el tiempo de las incubaciones a determinados niveles de temperatura.

A pesar de que parece que los métodos de PCR existen para cada aplicación, aún quedan determinadas plantillas de PCR que no se pueden manipular. La amplificación de fragmentos largos era difícil hasta que se halló que las ADN polimerasas con actividad de corrección de pruebas podían mejorar las amplificaciones largas de PCR (Barnes,

W. M. 1994, “PCR amplification of up to 35-kb ADN with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 91, no. 6, pp. 2216-2220; Mukai, H. & Nakagawa, T. 1996, “Long and accurate PCR (LA PCR) ”, Nippon rinsho. Japanese Journal of Clinical Medicine, vol. 54, no. 4, pp. 917-92) . Sin embargo, la eficacia de la amplificación de estas enzimas es relativamente pobre en comparación con las polimerasas estándar no correctoras de pruebas. Por este motivo, muchas empresas lanzaron al mercado mezclas de ADN polimerasas correctoras de pruebas y tradicionales de mayor proceso diseñadas para la amplificación de fragmentos largos y difíciles.

Uno de los problemas a los que aún se enfrenta la gente al realizar amplificaciones por PCR es muy frecuentemente cómo amplificar ADN rico en CG que contiene secuencias repetitivas que forman estructuras secundarias fuertes. Los ejemplos de tales estructuras incluyen repeticiones CG, CTG y GCC. Cuando se forman tales estructuras, sólo habrá una extensión parcial porque se asume que la ADN polimerasa colisiona con las estructuras bicatenarias secundarias. Esto da como resultado una extensión incompleta y una pobre eficacia de amplificación general. La extensión incompleta se refiere también a otro fenómeno comúnmente conocido. Si se detiene en la región repetitiva, la nueva cadena de ADN parcialmente extendida tiene en su extremo 3' un estiramiento de la secuencia repetitiva. Se libera en la siguiente etapa de desnaturalización y el extremo 3' se puede alinear en cualquier parte de la repetición, en la posición correcta o no, y se extenderá en la siguiente etapa de extensión. Debido a este mal alineamiento y muchas otras razones relacionadas con las condiciones experimentales, como concentraciones de

ADN polimerasa o plantilla de ADN, etc., los fragmentos terminan siendo de diferente longitud, que se pueden ver como una mancha típica en el gel de agarosa.

La inestabilidad de la repetición que causa la enfermedad es una forma importante y exclusiva de mutación que está ligada a más de 40 trastornos neurológicos, neurodegenerativos y neuromusculares. Estas repeticiones consisten en múltiples, con frecuencia docenas o cientos de copias de unidades de repetición cortas, típicamente de menos de 10 nucleótidos de largo. Las mutaciones de expansión de repetición de ADN son dinámicas e incipientes dentro de los tejidos y a través de generaciones. Los patrones de inestabilidad heredados y específicos de los tejidos son determinados tanto por elementos cis específicos de genes como por proteínas metabólicas del ADN de acción trans. La inestabilidad de la repetición probablemente implica la formación de estructuras de ADN usuales durante la replicación del ADN, la reparación y la recombinación. Avances experimentales para explicar los mecanismos de la inestabilidad de la repetición ampliaron nuestra comprensión de este proceso mutacional. Revelaron vías sorprendentes en las que las se pueden impulsar las vías metabólicas o proteger de la inestabilidad de la repetición.

Numerosas enfermedades heredadas comunes son causadas por expansión de secuencias de repetición ricas en CG (Mirkin, S. M. 2007, “Expandable ADN repeats and human disease”, Nature, vol. 447, no. 21, pp. 932-940; Mirkin, S. M. 2006, “ADN structures, repeat expansions and human hereditar y disorders”, Current Opinion in Structural Biology, vol. 16, no. 3, pp. 351-358) . Las estructuras secundarias formadas en estas repeticiones extendidas ricas en CG fueron consideradas como un mecanismo patológico principal.

Las estructuras secundarias y la dificultad de quedar en un estado monocatenario debido a la elevada temperatura de fusión de un fragmento rico en CG son los mayores obstáculos para bloquear la ADN polimerasa de la extensión durante la extensión de cebadores. Esto da como resultado una ineficaz extensión de cebadores y una pobre eficacia de amplificación.

Las estructuras secundarias se forman a menudo como resultado de las cadenas de ADN autocomplementarias que buscan sus mínimos estados energéticos estructurales. Si una estructura secundaria se puede tomar como un mínimo estado energético, se espera que, en condiciones fijas, el mínimo de energía sea el mismo para cada molécula del amplicón y las moléculas terminen finalmente en una estructura secundaria similar.

Sin embargo, en fragmentos largos y repetitivos, el proceso es más complicado y no es muy probable una única estructura, sino que más bien se hallan múltiples estructuras con estados energéticos mínimos muy similares.

Se pueden realizar análisis de diagnóstico de la longitud de la extensión de la repetición con... [Seguir leyendo]

1. Un método de reacción de extensión de cebadores para la amplificación de ADN independiente de la estructura que comprende

- preparar una mezcla de reacción que contiene la muestra de ADN, cebadores, una o múltiples enzimas capaces de sintetizar una cadena de ácido nucleico complementaria de la cadena de ácido nucleico original, como una mezcla de ADN polimerasa termoestable de dNTP y un tampón,

- desnaturalizar el ADN en una etapa de desnaturalización,

- alinear los cebadores en una etapa de alineamiento,

- extender los cebadores alineados en una etapa de extensión para obtener ADN amplificado,

caracterizado porque en la etapa de extensión, la temperatura primero se eleva de la temperatura de alineamiento a la primer temperatura de extensión en el intervalo d.

7. 90 °C, luego fluctúa hasta la segunda temperatura de extensión mayor en el intervalo d.

7. 95 °C y vuelve a la primera temperatura de extensión menor para una pluralidad de ciclos para desestabilizar las estructuras secundarias en el ADN para permitir la extensión.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque las etapas se repiten para una pluralidad de ciclos.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la primera temperatura de extensión está en el intervalo d.

7. 78 ºC, com.

7. 78 ºC.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la segunda temperatura de extensión está en el intervalo d.

8. 83 °C.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el ciclo de fluctuación entre la primera y la segunda temperatura de extensión se repite al menos 3 veces, con preferencia, 2030 veces, pero incluso cientos de veces en cada etapa de extensión.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la etapa de extensión, la tasa de fluctuación de la temperatura está en el intervalo de 0, 01-10 ºC/s, con preferencia, 0, 01-1 °C/s, como aproximadamente 0, 1 °C/s.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el ADN contiene repeticiones ricas en GC, CTG o GCC.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la mezcla de reacción contiene codisolventes, tales como DMSO, glicerol o betaína.

9. Un método de reacción en cadena de polimerasa, caracterizado porque se usa la reacción de extensión de cebadores de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para amplificar ADN.

10. El método de reacción en cadena de polimerasa de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque es un método de PCR cuantitativo o PCR de transcripción inversa.

11. Un método para diagnosticar enfermedades o trastornos relacionados son el ADN que contiene secuencias de repetición que forman estructuras secundarias, caracterizado porque el método de reacción en cadena de polimerasa de acuerdo con la reivindicación 9 se usa para amplificar dicho ADN para fines de diagnóstico.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque la enfermedad es síndrome de X frágil.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque la enfermedad es distrofia miotónica.

14. Un método de secuenciación de ADN, caracterizado porque se usa el método de reacción de extensión de cebadores de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en la secuenciación.

15. Un método para preparar fragmentos de ADN rotulados para ensayos de hibridación, caracterizado porque se usa la reacción de PCR de acuerdo con la reivindicación 9 para amplificar ADN.

16. Un termociclador que comprende un código de programa ejecutable por ordenador almacenado operativo para realizar el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

17. Un medio de almacenamiento de datos legibles por ordenador que tiene un código de programa ejecutable por ordenador almacenado operativo para realizar el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-15.