Método para producir proteínas recombinantes con un contenido constante de pCO2 en el medio.

Un mélodo para la producción recombinante de un polipéptido en una célula huésped CHO modificada en elciclo de citrato para expresar una carboxilasa piruvato citosólica,

el cual comprende las etapas siguientes:

(a) cullivar la citada célula huésped CHO en un medio adecuado bajo condiciones que permilen la expresióndel polipéptido, en el que el conlenido de CO, (pCO,) disuello en el medio se manliene en un valor conslanleen el rango de 12,5% a 17,5%; y

(b) recuperar el polipéplido de la célula o del medio.

Método para producir proteínas recombinantes con un contenido constante de pC02 en el medio.

La presente invención se refiere a un método para la producción recombinante de un polipéptido en una célula huésped eucariota modificado en el ciclo de citrato, para expresar una carboxilasa piruvato citosólica, en donde la célula se cultiva en un medio con un contenido de CO, (pCO, ) disuelto que se mantiene a un valor constante en el rango de 12.5 a 17.5%.

La producción tonelada escala de proteínas terapéuticas para tratamientos especificos implica nuevos requisitos relativos a la expresión y sistemas de producción. Los sistemas de expresión usados son, entre otros, los sistemas de cultivo de células animales. La capacidad de las células animales a las proteínas correctamente plegadas y

modificar después de la traducción es, sobre todo, un requisito para la aplicación clínica en humanos. En la actualidad, casi el 70% de todas las proteínas recombinantes se producen en las células animales en la industria farmacéutica, la mayoria de éstos en células CHO (ovario de hámster chino células) (Wurm, 2004) . En comparación con los sistemas microbiológicos, sin embargo, los procesos de cultivo de células animales se caracterizan por la generación de tiempo más larga y una densidad celular final de las fermentaciones. Por lo tanto, los títulos de producto y los rendimientos de espacio-tiempo son menores que en los procesos microbiológicos. Una pOSibilidad para compensar esta desventaja es la ingeniería metabólica, es decir el control del crecimiento celular y la reducción al mínimo, la muerte celular programada, por modificación genética de las células productoras. Además de los enfoques genéticos, las estrategias de control del cultivo resultan en la optimización adecuada acerca al potencial de que a menudo se subestima. Es, por ejemplo, posible influir de manera eficiente glicosilación, el metabolismo del

carbono, el crecimiento celular y la muerte celular mediante una supervisión del procedimiento y de las estrategias de control, así como la composición del medio de cultivo.

Así, el desarrollo de procedimiento tiene como objetivo no sólo en el desarrollo de líneas de células metabólica mente optimizado, sino también a la máxima explotación del potencial de una línea celular existente por las condiciones del

medio óptima y un control óptimo del proceso. Aparte de los parámetros de proceso fácilmente controlables tales como el contenido de oxígeno y temperatura, factores de influencia más complejos tales como el contenido de dióxido de carbono disuelto se tienen en cuenta para el control de procesos. En los procesos de cultivo de células animales, C02 se acumula como producto final en forma físicamente disuelto químicamente y disociado como hidrogenocarbonato en medios de cultivo acuosos. Hoy en día, el desarrollo hacia procesos de alta densidad celular utilizando células animales alimentados en los resultados de los procesos por lotes, en conjunción con industrialmente utilizados fermentadores de gran volumen y presiones hidrostáticas que reinan en ellos, es decir, en C02 presiones parciales de 150-200 mm Hg, que, en consecuencia, son cinco veces más altos que los valores fisiológicos de células de 31-54 mm Hg. Por ejemplo, para la provisión de polipéptidos (citocinas) producidas por células CHO recombinantes, dichas células fueron cultivadas a 37'C y 5% CO, (36 mm Hg pCO, ) con el fin de expresar las citoquinas recombinantes (EE.UU. 6406888B1) . Fogolin et al., Journal of Biotechnology, 2004, 109, 179-191 muestra que la linea modificada genética de células CHO-K1-hGM-CSF expresa una piruvato carboxilasa de levadura recombinante (PYC2) a 37'C y 5% de CO, . Los resultados de este estudio revelaron que la expresión de PYC2 y una temperatura de cultivo reducida tienen un efecto aditivo sobre la productividad específica de la célula de la linea celular modificada genética CHO-K1-hGM-CSF. Además, los efectos de la pCO, elevadas, osmolaridad sobre la tasa de crecimiento específico y la tasa de producción de tPA humano de una linea celular CHO recombinante han sido estudiadas por Kimura y Miller, Biotechnology and Bioengineering, 1996, 52, 152-160. Los medios utilizados para los experimentos en este estudio contienen 36 mm Hg pCa, (5% CO, ) , 140, 195, 250 mm Hg

pC02. Sin embargo, estos autores fueron de la opinión de que la mayor tasa de producción de proteínas recombinantes se puede lograr a 37'C y 36 mm Hg pCO, (5% de CO, ) . Los efectos adversos sobre el crecimiento y la productividad de los hibridomas, NSO, CHO, BHK y células de insecto se ha informado de concentraciones tan altas pC02. En fermentadores industriales a gran escala, la acumulación de C02 es un factor restrictivo. La desorción de CO2 disuelto del medio de cultivo es un desafío para la ingeniería de procesos. Por lo tanto, el suministro de oxígeno para las células cultivadas tiene que ser proporcionado. Corrección de las variables para mejorar la transferencia de oxígeno en la fase liquida son, por ejemplo, la velocidad del agitador y el flujo volumétrico de gas. Sin embargo, estos no pueden ser modificados libremente debido a la tensión de cizalladura parcialmente celular interrumpiendo y formación de espuma.

Por lo tanto, el problema técnico subyacente de la presente invención es proporcionar un método optimizado para la producción recombinante de proteínas en células huésped eucariotas que supere las desventajas descritas anteriormente, es decir, que de principio a fin porporcione un contenido óptimo de C02 físicamente disueltos en el medio.

La solución de este problema técnico se proporciona por las realizaciones descritas en las reivindicaciones.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para la producción de un recombinante de un polipéptido en una célula huésped CHO modificado en el ciclo de citrato para expresar una piruvato carboxilasa citosólica, comprendiendo dicho método los siguientes pasos:

(a) el cultivo de dicha célula huésped CHO en un medio apropiado bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido, en dónde el contenido del CO, (pCO, ) disuelto en el medio se mantiene a un valor constante en el rango de 12.5 a 17.5%; y

(b) recuperación del polipéptido de la célula o del medio.

La estrategia que conduce a la presente invención se basa en el enfoque de controlar el valor establecido de pCO, con control simultáneo de oxígeno disuelto, el pH y la sobrepresión en el reactor. Este enfoque racional del control desacoplado de parámetros como número posible asociados con pCO, dificultades relacionadas con el resultado en el descubrimiento sorprendente que el rendimiento de la proteína producida de forma recombinante se incrementó inesperadamente con un valor de pCO, mantiene constante en el rango de 12.5% a 17.5 de oxígeno disuelto CO, . Además, el control de las concentraciones de pCO, más de todo el proceso de fermentación tuvo un efecto positivo sobre la viabilidad del cultivo y se dejó para una fase estacionaria prolongada de una alta densidad celular. Los respectivos resultados de la estrategia resultante en la presente invención cuando se aplica al cultivo de células animales se resumen a continuación:

(a) Control de pCO, Sobre la base de una sonda in situ esterilizable pCO" un controlador de PCO, fue desarrollado por los estudios que cumplen con los requisitos de la industria y que se aplicó con éxito en el desarrollo de la fermentación. Con el control simultaneo e independiente de PO, y pH, pCO, este controlador permite tanto, pCOz-estática cultura y la generación de perfiles de valor establecido para pCO, . Aplicaciones en modo fed-batch y chemostat se establecieron con éxito en la escala L 1 -L 10. El rango de control es 1.5 a 25.0% pCO, . Asi, para las emisiones de CO, de los parámetros, es posible hacer frente a los problemas de la industria en pequeña escala.

(b) Control de sobrepresión Una válvula de sobrepresión fue desarrollado para escalas de 1 L (hasta 150 mbar de sobrepresión) y 10 L (hasta 1000 bar de sobrepresión) , que puede ser utilizado independientemente de los controles para pCO" pO, y pH. Así, los problemas de transmisión de escala en bioprocesos industriales (presión hidrostática, el tiempo de mezclado) pueden ser representados en una escala pequeña.

(e) Agentes de ajuste de pH Fue posible demostrar que el uso de Na, C03 para básicos del ajuste del pH da como resultado una mayor densidad de células viables, periodo prolongado cultivo viable y, en consecuencia, un aumento del espacio

tiempo rendimiento de una proteina de fusión de anticuerpos monoclonales en cultivos de CHO.

... [Seguir leyendo]

1. Un mélodo para la producción recombinante de un polipéptido en una célula huésped CHO modificada en el

ciclo de citrato para expresar una carboxilasa piruvato citosólica, el cual comprende las etapas siguientes:

(a) cullivar la citada célula huésped CHO en un medio adecuado bajo condiciones que permilen la expresión del polipéptido, en el que el conlenido de CO, (pCO, ) disuello en el medio se manliene en un valor conslanle en el rango de 12, 5% a 17, 5%; y

(b) recuperar el polipéplido de la célula o del medio.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la célula es CHO-hGM-CSF-PYC2.

3. El método según la reivindicaciones 1 o 2, en el que el polipéptido es una proteína de fusión, un anticuerpo o un fragmento del mismo, un factor de ¡nterferon, citoquina o crecimiento.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se realiza como método fed

balch.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el conlenido de CO, (pCO, ) disuello en el

medio se mantiene a un valor constante por medio de un sistema de control en cascada con un pC02

conlrolador a Iravés de conlroladores de flujo másico (MFC) .

compensada por una disminución de la proporción de C02 en el aire de suministro.

6. El método según la reivindicación 5, en el que la proporción de C02 en el aire de suministro se incrementó en un sobrecorte del valor de ajusle de pCO, en el medio, y la proporción de CO, en el aire de suminislro se disminuye por la superación del valor de ajusle de pCO, en la medio, y el conlrolador en cascada abre un MFC adicional para la enlrega de N, si la superación del valor eslablecido no puede ser suficienlemenle FIGURA 1

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108 781

Tiempo de proceso [h) FIGURA 36

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FIGURA 37

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13

12

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Tiempo de proceso [h]

FIGURA 38

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Tiempo de proceso [h)

FIGURA 39

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100 150 lOO 250 350 400

Tiempo de proceso [h)

FIGURA 40

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O 50 100 150 200 %SO 350 400

Tiempo de proceso [h]

FIGURA 41

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Tiempo de proceso [h]

FIGURA 42

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4.0

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Tiempo de proceso [h]

FIGURA 43

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

O.!

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FIGURA 44

pe0, no controlado Batch Fed-Batch

1 6

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0.1

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150 lOO 150 300 350

Tiempo de proceso [h]

FIGURA 45

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1.1

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6.1

6.1

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Batch Fed-Batch

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••• Entrada en la fase de • crecimiento estacionario

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O 50 100 150 200 :50 350

Tiempo de proceso [h)

FIGURA 46

7.4

7.3

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7.0 :

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6.9

6.8

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6.6

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Batch Fed-Batch

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Tiempo de proceso [h] FIGURA 47

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7.3

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6.9

6.8

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Tiempo de proceso [h] FIGURA 48

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Batch Fed-Batch

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0.8

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O.l

100 158 200 250 300 3S8

Tiempo de proceso [h] FIGURA 49