Método para producir derivados funcionalizados de ácido hialurónico y formación de hidrogeles de los mismos.

Un proceso para producir derivados funcionalizados de ácido hialurónico que comprende las siguientes etapasconsecutivas:

a) activación de por lo menos un grupo hidroxilo del ácido hialurónico, en forma de una sal del mismosoluble en disolventes orgánicos, por reacción de dicha sal de ácido hialurónico en un disolvente apróticopolar, con un agente de carbonilación seleccionado de ésteres fenílicos carbónicos y ésteres fenílicoshalofórmicos;

b) reacción de la sal de ácido hialurónico activada resultante de la etapa a), a través de una reacción desustitución nucleófila con un compuesto de la fórmula general NH2-R, en la que R está seleccionado delgrupo que consiste en NH2, un grupo aminoalquilo, una cadena de alquilo o una cadena de arilalquilo, unacadena poliacrílica, una cadena de polioxietileno, un fármaco, un polímero o una proteína.

Método para producir derivados funcionalizados de ácido hialurónico y formación de hidrogeles de los mismos

Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de derivados de ácido hialurónico funcionalizados y de hidrogeles relacionados. Más particularmente, la presente invención se refiere a una metodología en dos etapas útil para insertar grupos funcionales en ácido hialurónico, a través de la formación de un grupo activo específico en los grupos hidroxilo de ácido hialurónico y la sustitución posterior del grupo activo insertado, con una porción colgante que contiene, como porción terminal, por lo menos un grupo funcional nucleófilo. El grupo insertado mediante una sustitución nucleófila puede contener, como otra porción terminal, otro grupo funcional nucleófilo aprovechable para funcionalizaciones químicas adicionales, en particular para favorecer la reticulación de cadenas de ácido hialurónico que producen hidrogeles.

Técnica anterior

El ácido hialurónico (HA) es el glicosaminoglicano no sulfatado más abundante presente en la matriz extracelular de todos los tejidos; el HA es un polisacárido constituido por unidades repetitivas de ácido D–

glucurónico (GlcUA) y N–acetil–D–glucosamina (GlcNAc) cuya estructura química puede representarse por la siguiente fórmula que muestra dos unidades repetitivas consecutivas (el número n de unidades repetitivas podría ser tal que determine un peso molecular comprendido entre 50.000 y varios millones de Dalton) .

El ácido hialurónico participa activamente en un número de procesos biológicos importantes, tales como la movilidad celular, la diferenciación celular y la cicatrización. En particular, el HA desempeña un papel estructural fundamental en la organización de la matriz extracelular de cartílago que tiene lugar para la formación del proteoglicano más abundante, es decir, el agrecano.

El ácido hialurónico con alto peso molecular se usa en viscocirugía y viscosuplementación, y este se usa en el campo de la oftalmología y para reducir el dolor en la artrosis como un lubricante que puede aplicarse a través de inyecciones intra–articulares.

Recientemente, varios derivados de HA reticulados o funcionales se han producido como películas o esponjas para su aplicación sobre las heridas, en las que este producto tiene propiedades de curación de tejidos.

En el campo de la ingeniería de tejidos – tema emergente que se refiere al desarrollo de tecnologías útiles para obtener la regeneración o la sustitución completa de tejidos humanos dañados – el HA se ha empleado en gran 40 medida para la producción de estructuras porosas tridimensionales como soportes. Estas matrices mejoran el crecimiento y la diferenciación celular del tejido para favorecer la reconstrucción y la regeneración de los tejidos.

Para tales aplicaciones, el HA es útil cuando se sustituye adecuadamente para obtener hidrogeles. Debido a que los hidrogeles conocidos están constituidos por polímeros naturales o sintéticos o sus derivados o por

combinaciones de polímeros naturales y sintéticos, cuyas moléculas interactúan como resultado de las interacciones de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, enlaces electrostáticos o químicos, los hidrogeles son por lo tanto unas redes de polímeros hidrófilos capaces de absorber agua hasta cientos de veces su peso en seco. Considerando sus propiedades hidrófilas y su biocompatibilidad potencial, los hidrogeles reciben un interés creciente para aplicaciones farmacéuticas y farmacéuticas–biomédicas.

La funcionalización química de la estructura de HA de polisacárido insertando grupos funcionales colgantes tiene el objetivo de obtener dispositivos farmacéuticos para prolongar la liberación de fármacos (sistemas de administración de fármacos) ; en tales sistemas, el fármaco está unido física o químicamente al portador de polisacárido, y este se libera siguiendo las formas y el tiempo capaces de mejorar la biodisponibilidad del fármaco.

Considerando el gran interés hacia las aplicaciones farmacéuticas, biomédicas y cosméticas mencionadas del ácido hialurónico, es evidente la elevada demanda de nuevas estrategias químicas para permitir unas modificaciones del HA nuevas y más simples. Estos nuevos derivados pueden emplearse entonces para adecuarse a las diversas aplicaciones posibles.

En el pasado, se han descrito varias modificaciones químicas del ácido hialurónico que se refieren a sus 5 funcionalidades de hidroxilo y carboxilo y varios derivados de HA para su aplicación en el campo biomédico o farmacéutico.

Como ejemplo, la patente de los EE. UU. con n.º 4582865 (Balasz y col. de Biomatrix Inc.) describe la reticulación de HA por reacción con divinilsulfona en unas condiciones sumamente básicas. La solicitud de patente europea EP 0216453 (Fidia S.p.A.) describe esterificaciones de sales de hialuronato con haluros de alquilo en disolventes apróticos polares. Tales derivados han encontrado grandes aplicaciones en el campo farmacéutico, tal como soportes para la ingeniería de tejidos y como dispositivos para controlar la liberación de fármacos. Estos derivados de HA–éster han modificado las características fisicoquímicas, tales como una solubilidad aumentada en disolventes orgánicos, tal como dimetilsulfóxido que mejoran los rendimientos industriales para obtener fibras,

soportes porosos y películas.

Recientemente, se han propuesto otras estrategias químicas diferentes para obtener una funcionalización de ácido hialurónico con cadenas colgantes funcionales, empleando reacciones tanto en los grupos carboxilo del resto glucurónico como en los grupos hidroxilo de las unidades repetitivas. En particular, varios documentos describen la química de la carbodiimida (empleando compuestos que tienen la fórmula R1–N=C=N–R2) para obtener una funcionalización química del resto D–glucurónico de HA.

Como ejemplo, Prestwich, Poyani y col. emplearon carbodiimidas solubles en agua para insertar cadenas colgantes de hidrazida en la estructura principal de hialuronano (la patente de los EE. UU. 5502081 de Prestwich y

col. de The Research Foundation de la State University de Nueva York; la patente de los EE. UU. 5616568 de T. Pouyany y col.; T. Pouyany, G. D. Prestwich Functionalized Derivatives of Hyaluronic Acid Oligosaccharides: Drug Carriers and Novel Biomaterials, Bioconjugate Chem., 1994, 5, 339–347) . En estos ejemplos, los grupos carboxilo del ácido hialurónico reaccionan con moléculas bifuncionales que tienen la fórmula general H2N–NH–COA–CO– NHNH2 en la que A es un grupo espaciador genérico, que produce derivados de ácido hialurónico funcionalizados que portan grupos hidrazida colgantes que tienen la fórmula HA–CONH–NH–CO–A–CO–NH–NH2. Siguiendo la misma línea de investigación, Vercruysse y col. (Vercruysse y col., “Synthesis and in Vitro Degradation of New Polyvalent Hydrazide Cross–Linked Hydrogels of Hyaluronic Acid, Bioconjugate Chem., 1997, 8, 686–694) describió cómo funcionalizar el ácido hialurónico usando moléculas que portan más de dos grupos terminales hidrazida, lo que permite una reticulación del polisacárido de partida, produciendo entonces hidrogeles.

Aeschlimann y col. (la patente de los EE. UU. 6630457 de Aeschlimann y col. de Othogene LLC que se corresponde con la patente europea con n.º EP 1757314) modificaron el método de activación del grupo carboxilo de HA propuesto por Pouyani, combinando el empleo de carbodiimidas solubles en agua con el uso de activadores nucleófilos tales como hidroxisuccinimidas e hidroxitriazoles. En particular, el método que se da a conocer trata de la introducción de nuevos grupos funcionales en la estructura principal de HA activando en primer lugar sus grupos carboxílicos produciendo grupos éster intermedios, sustituyendo entonces estos grupos salientes de éster usando moléculas que contienen un buen grupo nucleófilo en un lado y un grupo funcional químicamente protegido en otro lado. De esta forma, los productos intermedios activados por HA son más estables y la siguiente funcionalización por moléculas nucleófilas bifuncionales es entonces más selectiva. De tal forma, se han producido derivados de HA–

aldehído y amina adecuados para su reticulación posterior, obteniendo de este modo hidrogeles a base de HA biocompatibles.

Además, la solicitud de patente WO 02/098923 propuesta por Eurand Pharmaceuticals Ltd, de los inventores Mariotti y col., muestra los métodos para producir... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para producir derivados funcionalizados de ácido hialurónico que comprende las siguientes etapas consecutivas:

a) activación de por lo menos un grupo hidroxilo del ácido hialurónico, en forma de una sal del mismo soluble en disolventes orgánicos, por reacción de dicha sal de ácido hialurónico en un disolvente aprótico polar, con un agente de carbonilación seleccionado de ésteres fenílicos carbónicos y ésteres fenílicos halofórmicos; b) reacción de la sal de ácido hialurónico activada resultante de la etapa a) , a través de una reacción de sustitución nucleófila con un compuesto de la fórmula general NH2–R, en la que R está seleccionado del grupo que consiste en NH2, un grupo aminoalquilo, una cadena de alquilo o una cadena de arilalquilo, una cadena poliacrílica, una cadena de polioxietileno, un fármaco, un polímero o una proteína.

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho agente de carbonilación está seleccionado de bis (4 nitrofenilcarbonato) y clorofenilcarbonato.

3. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1–2, en el que dicho compuesto de la fórmula general NH2–R está seleccionado de hidrazina y un grupo diaminoalquilo de la fórmula NH2– (CH2) n–NH2 en la que n es un número entre 1 y 30, preferiblemente entre 1 y 10.

4. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1–3, en el que dicha sal de ácido hialurónico está seleccionada de sal de tetrabutilamonio y sal de cetiltrimetilamonio.

5. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1–4, en el que dicho disolvente aprótico polar está seleccionado del grupo que consiste en: dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dimetilacetamida y sus mezclas.

6. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1–5, en el que ambas etapas de activación (a) y de sustitución nucleófila (b) se llevan a cabo a una temperatura comprendida entre 10 ºC y 60 ºC.

7. Un proceso para la producción de hidrogel que consiste en someter un derivado funcionalizado de ácido hialurónico obtenido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1–6 a una autorreticulación en presencia de una carbodiimida como agente de activación, o a una reticulación química por medio del uso de agentes de reticulación bifuncionales o polifuncionales.

8. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1–6, en el que un derivado funcionalizado de ácido hialurónico en forma de sal obtenido a partir de dicha etapa b) se somete a una funcionalización adicional mediante una sustitución nucleófila por reacción con un compuesto de la fórmula Y–R’, en la que Y es un buen grupo saliente seleccionado de halógeno, N–oxisuccinimida, un alcoxilo con 1–6 átomos de carbono, o Y representa la porción electrófila de un anhídrido o un epóxido, y R’ está seleccionado del grupo que consiste en: grupo acriloílo o metacriloílo ambos opcionalmente sustituidos o un grupo que pertenece a una molécula, soluble en disolventes orgánicos o en disolventes acuosos.

9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha funcionalización adicional se realiza en un medio

acuoso o disolvente orgánico, preferiblemente un disolvente aprótico polar seleccionado del grupo que consiste en: dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dimetilacetamida y sus mezclas.

10. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8–9, en el que dicha funcionalización adicional se realiza a una temperatura comprendida entre 5 ºC y 60 ºC.

11. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8–10, en el que dicha funcionalización adicional se realiza en presencia de un catalizador seleccionado del grupo que consiste en: dietilamina, trietilamina, dimetilaminopiridina y sus mezclas.

12. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8–11, en el que dicho compuesto de la fórmula Y– R’ se corresponde con anhídrido metacrílico, cloruro de metacriloílo, cloruro de acriloílo, acrilato de glicidilo o metacrilato de glicidilo.

13. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8–11, en el que dicho compuesto de la fórmula Y– R’ se corresponde con el éster de N–oxisuccinimida o diéster de N, N ’–dibenzoil–L–cistina o derivados similares.

14. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el derivado obtenido a partir de dicha funcionalización adicional se somete a un proceso de reducción para obtener un resto de benzoil–cisteína o sus derivados similares.

15. Un derivado funcionalizado de ácido hialurónico que tiene un peso molecular en el intervalo de 50.000 a

1.500.000 Dalton que puede obtenerse a partir del proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1–14.

16. Un derivado funcionalizado de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el grado de funcionalización molar está comprendido entre por lo menos un grupo hidroxilo y la totalidad de los grupos hidroxilo de ácido hialurónico.

17. Un derivado funcionalizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15–16, que puede obtenerse a 5 partir del proceso de la reivindicación 12.

18. Un hidrogel, que comprende el derivado funcionalizado de ácido hialurónico de acuerdo con la reivindicación 17, que puede obtenerse a partir de un proceso de fotorreticulación, en el que la concentración de dicho derivado funcionalizado en una disolución acuosa u orgánica está comprendida entre un 1 % en p/v y un 20 % en p/v.

19. Un hidrogel de acuerdo con la reivindicación 18, que puede obtenerse por irradiación con unas longitudes de onda máximas en el intervalo de 180 a 800 nm, en presencia o en ausencia de un iniciador de radicales con unos tiempos de irradiación variables desde 5 min hasta 10 horas.

20. Un hidrogel que comprende el derivado funcionalizado de ácido hialurónico de acuerdo con la reivindicación 17, que puede obtenerse a partir de un proceso de irradiación con rayos γ, microondas u otras radiaciones ionizantes.

21. Un derivado funcionalizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15–16, que puede obtenerse a partir del proceso de cualquiera de las reivindicaciones 13–14. 20

22. Un hidrogel que comprende el derivado funcionalizado de ácido hialurónico de acuerdo con la reivindicación 21, que puede obtenerse a partir de un proceso de auto–oxidación por exposición al aire.

23. Hidrogeles obtenidos a partir del proceso de la reivindicación 7 o de acuerdo con las reivindicaciones 18–20 o 25 22, producidos en forma de nano– o micropartículas, películas, membranas, fibras y soportes.

24. Uso de hidrogeles de acuerdo con la reivindicación 23, para la producción de sistemas para la liberación sostenida de fármacos o material genético, o sistemas para el recubrimiento de heridas, órganos o tejidos, o materiales o soportes implantables para la regeneración de tejidos.