MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL SEXO EN PECES.

Método para la identificación del sexo en peces.

La presente invención se relaciona con el uso de una molécula asociada al ARN ribosómico 5S (ARNr 5S),

o de una molécula implicada en el transporte de proteínas que intervienen en la regulación de la transcripción del gen que codifica el ARNr 5S, como marcador para identificar el sexo en peces. Asimismo, la invención también se relaciona con un método para clasificar por sexos una población de peces que comprende la determinación del nivel de expresión de una molécula asociada al ARNr 5S, o de una molécula implicada en el transporte de proteínas que intervienen en la regulación de la transcripción del gen que codifica el ARNr 5S.

MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL SEXO EN PECES

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con un método para la determinación del sexo en peces mediante la detección de la expresión del ARN ribosómico 5S, 18S o 28S en las gónadas de dicho pez. La presente invención tiene su aplicación en el campo de la piscicultura (en el manejo y optimización de la cría de peces) , en el de las pesquerías (el estudio de las dinámicas de peces comerciales en provisión) y en el de la toxicología ambiental (estudio de los efectos biológicos de xenobióticos ambientales) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La estimación del estadio de madurez reproductiva, así como la determinación de la proporción de sexos de las poblaciones de peces en aguas europeas, es un requisito de la DCF (Data Collection Framework) de la Unión Europea como parte de la política para mejorar la gestión de las pesquerías. Para ello, es crucial identificar el sexo de los animales incluidos en estudios de mortalidad, crecimiento y de patrones de migración de las provisiones piscícolas, ya que puede haber diferencias importantes asociadas al sexo en estos parámetros. Estas diferencias así mismo, pueden ser decisivas en la determinación del éxito reproductor de dichas provisiones. Hoy en día, determinar la madurez reproductiva y el sexo en especies de peces comerciales es muy laborioso y frecuentemente surge la necesidad de analizar gónadas de un gran número de individuos mediante análisis visual o histológico en el laboratorio. Pero las campañas oceanográficas no siempre coinciden con la época reproductiva y esto dificulta (o imposibilita) la estimación del sexo. Un estudio más preciso de la estructura poblacional (proporción sexual y madurez) de peces comerciales mejoraría significativamente los modelos de evaluación de estas provisiones.

Por otro lado, los estudios de salud ambiental y biomonitorización de la polución se centran últimamente en descifrar los mecanismos de acción de los compuestos químicos liberados al medio. Las bases moleculares de estos mecanismos vienen siendo estudiados en especies centinela de la contaminación vía tecnologías denominadas “omic”-as (principalmente transcriptómica) . La alta sensibilidad de estas introduce

mucho ruido de fondo cuando se estudian machos y hembras por lo que los estudios en especies centinela se centran en organismos juveniles o de un sexo en particular pudiendo perder así mucha información. Por ello, existe la necesidad de revelar el sexo del organismo centinela objeto de estudio. Con ello, se lograría reducir el ruido presente en los perfiles de respuesta de muchos biomarcadores de exposición a xenobióticos. Por otra parte, algunos xenobióticos y factores abióticos, como por ejemplo la temperatura, la disponibilidad de oxigeno o el pH (todos ellos importantes actores en el proceso de cambio climático global) , pueden llegar a producir cambios relevantes en la determinación y diferenciación sexual de los organismos acuáticos. Por Ejemplo, recientemente, en la Reserva de la Biosfera de Urdaibai (Gernika) se ha descrito un porcentaje relativamente alto de machos de peces de la especie Chelon labrosus (muble) que muestran oocitos entre sus folículos espermáticos. Este fenómeno es denominado intersex y está asociado en el caso de los mubles de Gernika a la alta biodisponibilidad de alquilfenoles.

El mayor problema del cultivo de peces en estanques es la distinta velocidad de crecimiento de los peces machos y hembras. Para prevenir este problema, los estanques deben sembrarse únicamente con ejemplares de un único sexo, en lo que se denomina cultivo monosexo. Esta técnica se utiliza, por ejemplo, cuando se necesita producir peces grandes para el mercado y los machos se escogen porque crecen casi el doble que las hembras. El resultado del cultivo monosexo es una mejor fuente de proteína y una mayor ganancia para el piscicultor.

Así, uno de los mayores problemas a los que se enfrentan las piscifactorías es el control poblacional de los peces, para lo cual es necesario separar los peces por sexos, optimizando el rendimiento del cultivo de peces.

La determinación del sexo en peces puede llevarse a cabo de diferentes maneras, por ejemplo, mediante el sexado a mano, en donde el sexo del pez se puede distinguir visualmente inspeccionando la papila genital en la parte ventral del pez, observando los opérculos (lo que tapa a las branquias) o el orificio cloacal, el tamaño de las aletas dorsales, la coloración de las escamas, etc. El parámetro a elegir en el sexado dependerá de las características fenotípicas del pez en cuestión. Los piscicultores con experiencia pueden separar manualmente (sexar) cerca de 2000 peces al día, pero este método no es 100% efectivo.

Otros métodos de sexado incluyen el empleo de dispositivos capaces de medir simultáneamente varias características morfológicas que diferencian machos de hembras, o el empleo de marcadores moleculares que se expresan diferencialmente dependiendo del sexo del individuo.

La solicitud de patente US2008210766 describe un dispositivo para determinar el género de un pez mediante la medida de sus características morfológicas, como son la longitud del cuerpo, la longitud de la cabeza, la longitud del cuerpo, etc.

La solicitud de patente WO2009063101 describe un método para determinar el sexo de los peces basado en la diferencia de color entre las gónadas de los machos y las hembras, que consiste en la inserción de una sonda en las gónadas del pez y analizar el espectro de luz obtenido tras una radiación electromagnética sobre la gónada.

En la misma línea, la solicitud de patente US3859522 describe un método y un aparato para determinar el sexo de un pez basado en la distinta manera de dispersar la luz de las huevas presentes en el pez hembra y del esperma presente en el pez macho.

La solicitud de patente CN101429557 describe un método para determinar el sexo de los peces de la familia Pleuronectidae, que comprende extraer ADN de la aleta e identificar mediante AFLP (Amplified fragment length polymorphism) marcadores moleculares específicos de las hembras que presentan un peso molecular de 533 pb y 218 pb.

La solicitud de patente CN101240348 describe un método para el sexado genético de peces que comprende la extracción del ADN, el diseño y síntesis de cebadores específico de LAMP, y la detección de los productos de amplificación de LAMP para determinar el sexo del individuo, siendo la detección de los productos de amplificación indicativos de que el pez pertenece al sexo femenino.

Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de desarrollar métodos alternativos a los existentes en el estado de la técnica, que permitan la identificación del sexo en los peces para el establecimiento de cultivos monosexo.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente invención han descubierto que una simple electroforesis del ARN total obtenido a partir de una muestra biológica de las gónadas de un pez, presenta una distribución de bandas capaz de diferenciar individuos según el sexo. La aparición de una banda con un tamaño aproximado de 120 nucleótidos, que tras su secuenciación se vio que correspondía al ARN ribosómico 5S (ARNr 5S) , permite concluir que el pez es de sexo femenino (hembra) . Por otro lado, la aparición de una banda correspondiente al ARN ribosómico 18S (ARNr 18S) y/o al ARN ribosómico 18S (ARNr 28S) , permite concluir que el pez es de sexo maculino (macho) (Ver Ejemplo 1 y Figuras 1, 3 y 4) . Por lo tanto, según la presente invención, es posible emplear el ARN ribosómico presente en las gónadas de un pez como marcador para identificar el sexo de este.

Así, en un aspecto, la invención se relaciona con el uso del ARNr 5S, del ARNr 18S o del ARNr 28S como marcador para identificar el sexo de los peces. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para determinar el sexo de un pez que comprende detectar la expresión del ARNr 5S, del ARNr 18S y del ARNr 28S en una muestra biológica de las gónadas de dicho pez, en donde

-si la expresión del ARNr 5S detectada es mayor que la expresión del ARNr 18S o del ARNr 28S detectada, entonces el pez es de sexo femenino, o -si la expresión del ARNr 18S o del ARNr 28S detectada es mayor que la expresión del ARNr 5S detectada, entonces el pez es de sexo masculino.

Adicionalmente, los inventores también han descubierto que el nivel de expresión de dicho ARNr 5S es diferente en machos y hembras, pudiendo emplear el nivel de expresión del ARNr 5S como un nuevo marcador molecular para identificar el sexo de los peces. En concreto, los inventores han observado, tal como... [Seguir leyendo]

1. Uso de una molecula asociada al ARN ribos6mico 5S (ARNr 5S) como marcador para identificar el sexo de los peces.

2. Uso segun la reivindicación 1, en el que los peces se seleccionan del grupo que consiste en muble, pez cebra y merluza.

3. Metodo para clasificar por sexos una población de peces, en donde dicho metodo comprende

(i) determinar el nivel de expresión de una molecula asociada al ARN ribos6mico 5S (ARNr 5S) en las g6nadas procedentes de dicha población de peces, y

(ii) observar el patrón de distribución de los niveles de expresión obtenidos, en donde si aparecen dos poblaciones muestrales significativamente distintas entre st, entonces los individuos que forman parte de la población muestral que presenta el mayor nivel de expresión son hembras, y los individuos que forman parte de la población muestral que presenta el menor nivel de expresión son machos.

4. Metodo segun la reivindicación 3, en el que los individuos de la población de peces cuyos niveles de expresión esten significativamente desviados de la media de los niveles de expresión de cada una de las poblaciones muestrales, son machos intersex.

5. Metodo segun la reivindicación 3 6 4, en donde el nivel de expresión se mide mediante el empleo de una reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (RTPCR) .

6. Metodo segun la reivindicación 5, en el que el valor Ct de la población que presenta el menor nivel de expresión medio es igual o mayor en 5 unidades que el valor Ct de la población que presenta el mayor nivel de expresión medio.

7. Metodo segun la cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que la molecula asociada al ARNr 5S es el factor de transcripción general IIIA (TFIIIA) o la protetna 42sp43.

8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que el pez o la población de peces se selecciona del grupo que consiste en muble, pez cebra y merluza.

FIGURA 1

FIGURA 3

Hembra Macho

FIGURA 4

REGULACIÓN DE LATRANSCRIPCIÓN DE 5S ARNr

TFIIIA

ALMACENAMIENTO DE5S ARNr

TFIIIA

42sp43 (o p43)

TRANSPORTE NUCLEO/CITOPLASMÁTICO

ImportinasExportinas

Modificado deSzymánski et al, 2003

FIGURA 5