Método para determinar un régimen quimioterapéutico basado en la expresión de ERCC1.

Un método para determinar un régimen quimioterapéutico a base de platino para el tratamiento de un tumor en unpaciente,

que comprende:

(a) fijar una muestra tumoral e incluir la muestra fijada en parafina;

(b) aislar el ARNm de la muestra tumoral fijada incluida en parafina mediante el calentamiento de la muestra detejido en una solución que comprende una concentración eficaz de un compuesto caotrópico a una temperatura enel intervalo de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 ºC durante un periodo de tiempo de aproximadamente5 a aproximadamente 120 minutos y recuperando dicho ARNm de dicha solución caotrópica;

(c) someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores oligonucleotídicos;

(d) determinar la cantidad de ARNm de ERCC1 en la muestra amplificada,

(e) comparar la cantidad de ARNm de ERCC1 de la etapa (d) para una cantidad de ARNm de un gen de controlinterno; y

(f) determinar un régimen quimioterapéutico basado en platino en base a la cantidad de ARNm de ERCC1 en lamuestra amplificada y el nivel umbral para la expresión del gen ERCC1.

Método para determinar un régimen quimioterapéutico basado en la expresión de ERCC1

Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos de pronóstico que son útiles para medicina, en particular en la quimioterapia del cáncer. Más particularmente, la invención se refiere a la evaluación de la expresión de genes de células tumorales en un paciente. La supervivencia de los pacientes tratados con agentes quimioterapéuticos dirigidos al ADN, especialmente agentes que dañan el ADN mediante agentes platinados, se analiza examinando el ARNm expresado a partir de los genes implicados en la reparación del ADN en seres humanos.

Antecedentes de la invención El cáncer aparece cuando una célula normal sufre una transformación neoplásica y se convierte en una célula maligna. Las células transformadas (malignas) se escapan de los controles fisiológicos normales que especifican el fenotipo de la célula y refrenan la proliferación celular. Por consiguiente, las células transformadas en el cuerpo de un individuo proliferan y forman un tumor. Cuando se encuentra un tumor, el objetivo clínico es destruir las células malignas de forma selectiva al tiempo que se mitiga cualquier daño causado a las células normales en el tratamiento individual que se esté usando.

La quimioterapia se basa en el uso de fármacos que son selectivamente tóxicos (citotóxicos) para las células cancerosas. Se han desarrollado varias clases generales de fármacos quimioterapéuticos, incluidos fármacos que interfieren en la síntesis de los ácidos nucleicos, la síntesis de proteínas y otros procesos metabólicos vitales.

Generalmente estos se denominan fármacos antimetabolitos. Otras clases de fármacos quimioterapéuticos producen daños en el ADN celular. Generalmente, los fármacos de estas clases se denominan genotóxicos. Sin embargo, a menudo la susceptibilidad de una neoplasia individual a un fármaco quimioterapéutico o combinación de fármacos deseados solo se puede evaluar con precisión después de un periodo de tratamiento de ensayo. El tiempo invertido en un periodo de ensayo sin éxito plantea un riesgo significativo en el tratamiento clínico de las neoplasias malignas agresivas.

La reparación de los daños en el ADN celular es un importante proceso biológico llevado cabo por la maquinaria de reparación del ADN enzimática de una célula. Las lesiones sin reparar en el genoma de una célula pueden impedir la replicación del ADN, alterar la fidelidad de la replicación de ADN recién sintetizado y/o dificultar la expresión de genes necesarios para la supervivencia celular. Por tanto, los fármacos genotóxicos generalmente se consideran más tóxicos para las células en división activas que participan en la síntesis del ADN que para las células quiescentes que no están en división. Las células normales de muchos tejidos corporales son quiescentes y con poca frecuencia vuelven a entrar en el ciclo celular y se dividen. Generalmente se proporciona mayor tiempo entre rondas de división celular para la reparación de los daños en el ADN de las células normales producidos por genotoxinas quimioterapéuticas. Como resultado, se consigue alguna selectividad para matar las células cancerosas. Muchos regímenes de tratamiento reflejan intentos de mejorar la selectividad de las células cancerosas coadministrando fármacos quimioterapéuticos pertenecientes a dos o más de estas clases generales.

Dado que la quimioterapia eficaz en los tumores sólidos normalmente requiere una combinación de agentes, la 45 identificación y la cuantificación de determinantes de la resistencia o la sensibilidad a cada fármaco se han convertido en una herramienta importante para diseñar una quimioterapia de combinación individual.

Dos fármacos anticancerosos genotóxicos ampliamente usados que se ha demostrado que dañan el ADN son el cisplatino (DDP) y el carboplatino. Actualmente, el cisplatino y/o el carboplatino se usan en el tratamiento de varias neoplasias determinadas de origen epitelial y mesenquimatoso, incluidos carcinomas y sarcomas de los tractos respiratorio, gastrointestinal y reproductor, del sistema nervioso central, y de origen escamoso en la cabeza y el cuello. El cisplatino combinado con otros agentes es el fármaco que se prefiere en la actualidad para el tratamiento del carcinoma testicular y, en muchos casos, produce una remisión duradera. (Loehrer y col., 1984, 100 Ann. Int. Med. 704) . El cisplatino (DDP) rompe la estructura del ADN a través de la formación de aductos intracatenarios. La 55 resistencia a agentes platinados, tales como el DDP, se ha atribuido a una mayor tolerancia a los aductos de platino, a la disminución de la acumulación del fármaco o a una reparación reforzada del ADN. Aunque la resistencia al DDP es multifactorial, es probable que las alteraciones en los mecanismos de reparación del ADN desempeñen un papel significativo. La reparación por escisión de aductos voluminosos de ADN, tales como los formados por los agentes de platino, parece estar mediada por genes implicados en el reconocimiento de daños en el ADN y su escisión. Cleaver y col., Carcinogenesis 11:875-882 (1990) ; Hoeijmakers y col., Cancer Cells 2:311-320 (1990) ; Shivji y col., Cell 69:367-374 (1992) . De hecho, las células portadoras de un defecto genético en uno o más elementos de la maquinaria de reparación enzimática del ADN son extremadamente sensibles al cisplatino. Fraval y col., (1978) , 51 Mutat. Res. 121, Beck y Brubaker (1973) , 116 J. Bacteriol 1247.

El gen de complementación cruzada de reparación por escisión (ERCC1) es esencial en la reparación de los aductos de ADN. El gen ERCC1 humano se ha clonado. Westerveld y col., Nature (London) 310:425-428 (1984) ; Tanaka y col., Nature 348:73-76 (1990) y Van Duir y col., Cell, 44, 913-923 (1986) . En varios estudios que usan líneas celulares mutantes humanas y de hámster que son defectivas en este gen y en estudios con tejidos tumorales humanos se ha indicado que el producto codificado por ERCC1 está implicado en la reparación por escisión de los aductos de ADN de platino. Dabholkar y col. J. Natl. Cancer Inst. 84:1512-1517 (1992) ; Dijt y col. Cancer Res.

48:6058-6062 (1988) ; Hansson y col., Nucleic Acids Res. 18: 35-40 (1990) .

Cuando se transfecta en células CHO deficientes en reparación de ADN, el ERCC1 confiere resistencia celular al cisplatino, además de la capacidad para reparar los aductos de ADN con platino. Hansson y col., Nucleic Acids Res.

18: 35-40 (1990) . Los modelos aceptados actualmente de reparación por escisión sugieren que la etapa de 10 reconocimiento/escisión de daños limita la velocidad del proceso de reparación por escisión.

Se han estudiado los niveles relativos de expresión de los genes para reparación por escisión como el ERCC1 en células malignas de pacientes de cáncer que reciben tratamiento a base de platino. Dabholkar y col., J. Natl. Cancer Inst. 84:1512-1517 (1992) . Se ha notificado que la sobreexpresión de ERCC1 en pacientes de cáncer gástrico tiene un impacto negativo sobre la respuesta del tumor y la supervivencia última cuando se tratan con el régimen quimioterapéutico del cisplatino (DDP) /fluorouracilo (Metzger, y col., J Clin Oncol 16: 309, 1998) . Pruebas recientes indican que la gemcitabina (Gem) puede modular la actividad de reparación por escisión de nucleótidos de ERCC1 (NER) . Por tanto, los niveles intratumorales de expresión de ERCC1 pueden ser un factor pronóstico importante para determinar si el DDP y la GEM serán una terapéutica eficaz en pacientes con cáncer.

Las muestras más patológicas se fijan e incluyen en parafina (PFE) de forma rutinaria para permitir el análisis histológico y la posterior conservación para archivo. Por tanto, la mayoría de las muestras de tejido para biopsia no son útiles para el análisis de la expresión génica porque estos estudios requieren una elevada integridad del ARN para que se pueda realizar una medida precisa de la expresión génica. En la actualidad, los niveles de expresión génica solo pueden monitorizarse de forma cualitativa en estas muestras fijadas e incluidas usando tinción inmunohistoquímica para monitorizar los niveles de expresión de proteínas.

Hasta ahora, los estudios de expresión génica cuantitativa, incluidos aquéllos de expresión de ERCC1, se han limitado a la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) del

ARN de tejido fresco o congelado. La patente de EE.UU. Nº 5.705.336 de Reed y col., divulga un método de cuantificación del ARNm de ERCC1 de tejido tumoral de ovarios y de determinar si dicho tejido será sensible a la quimioterapia a base de platino. Reed y col., cuantifican el... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar un régimen quimioterapéutico a base de platino para el tratamiento de un tumor en un paciente, que comprende: 5

(a) fijar una muestra tumoral e incluir la muestra fijada en parafina;

(b) aislar el ARNm de la muestra tumoral fijada incluida en parafina mediante el calentamiento de la muestra de tejido en una solución que comprende una concentración eficaz de un compuesto caotrópico a una temperatura en

el intervalo de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 ºC durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 a aproximadamente 120 minutos y recuperando dicho ARNm de dicha solución caotrópica;

(c) someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores oligonucleotídicos;

(d) determinar la cantidad de ARNm de ERCC1 en la muestra amplificada,

(e) comparar la cantidad de ARNm de ERCC1 de la etapa (d) para una cantidad de ARNm de un gen de control interno; y

(f) determinar un régimen quimioterapéutico basado en platino en base a la cantidad de ARNm de ERCC1 en la muestra amplificada y el nivel umbral para la expresión del gen ERCC1.

2. El método de la reivindicación 1, en el que los cebadores oligonucleotídicos consisten en la SEC ID Nº 1 o un cebador oligonucleotídico con una identidad de al menos aproximadamente un 80% con la misma y la SEC ID Nº 2 o 25 un cebador oligonucleotídico con una identidad de al menos aproximadamente un 80% con la misma.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el tumor es un tumo de cáncer no microcítico (CPNM) .

4. El método de la reivindicación 1, en el que el nivel umbral de la expresión del gen ERCC1 es aproximadamente 30 6, 7 x 10-3 veces el nivel de expresión de un gen de control interno.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el régimen quimioterapéutico basado en platino comprende un agente genotóxico que consiste en gemcitabina, cisplatino o una combinación de los mismos cuando el nivel de expresión génica determinado para ERCC1 es inferior a un umbral predeterminado.

6. Un método para determinar el nivel de expresión de ERCC1 en una muestra de tejido fijada incluida en parafina, que comprende:

(a) desparafinizar la muestra de tejido para obtener una muestra desparafinizada; 40

(b) aislar el ARNm de la muestra desparafinizada en presencia de una cantidad eficaz de un compuesto caotrópico calentando la muestra de tejido en una solución que comprende una concentración eficaz de un compuesto caotrópico hasta una temperatura en el intervalo de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 ºC durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 a aproximadamente 120 minutos y recuperando dicho ARNm de dicha 45 solución caotrópica;

(c) someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores oligonucleotídicos capaces de amplificar una región del gen ERCC1 para obtener una muestra amplificada; y

(d) determinar la cantidad de ARNm de ERCC1 con respecto a la cantidad de ARNm de un gen de control interno.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el par de cebadores oligonucleotídicos consisten en la SEC ID Nº 1 o un cebador oligonucleotídico con una identidad de al menos un 80% con la misma y la SEC ID Nº 2 o un cebador oligonucleotídico con una identidad de al menos un 80% con la misma.

8. El método de la reivindicación 6, en el que el gen de control interno es la β-actina.

9. Un kit para detectar la expresión de un gen ERCC1 que comprende al menos dos cebadores oligonucleotídicos

que consisten en la SEC ID Nº 1 o un cebador oligonucleotídico con una identidad de al menos un 80% con la 60 misma y la SEC ID Nº 2 o un cebador oligonucleotídico con una identidad de al menos un 80% con la misma.