Método de selección de péptidos.

Un método in vitro para seleccionar un péptido que es útil en la prevención y/o tratamiento de un trastorno dehipersensibilidad mediado por células T que reconocen el antígeno diana,

que comprende las siguientes etapas:

(i) tratar un sistema de presentación de antígenos libre de transformación con una pluralidad de péptidoscomprendiendo cada uno un epítopo de células T del antígeno diana;

(ii) analizar unión de los péptidos a moléculas del MHC de clase I o de clase II en el sistema añadiendo células T ymidiendo activación de células T;

(iii) identificar un péptido que es capaz de unir una molécula del MHC de clase I o de clase II en el sistema depresentación de antígenos libre de transformación y que se presenta a una célula T como siendo un péptido capazde inducir tolerancia al antígeno diana in vivo cuando se administra a un sujeto, que es útil en la prevención y/o eltratamiento del trastorno de hipersensibilidad; y

(iv) seleccionar un péptido que se identifica como que es capaz de unir una molécula del MHC de clase I o de claseII en el sistema de presentación de antígenos libre de transformación y que se presenta a una célula T en la etapa(iii).

Método de selección de péptidos La presente invención se refiere a un método para seleccionar un péptido tolerogénico, péptido que puede ser útil en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad.

Antecedentes En una respuesta inmunitaria adaptativa, los linfocitos T pueden reconocer epítopos internos de un antígeno proteico. Las células presentadoras de antígeno (APC) toman antígenos proteicos y los degradan en fragmentos peptídicos cortos. Un péptido puede unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I o II dentro de la célula y llevarse hasta la superficie celular. Cuando se presenta en la superficie celular junto con una molécula del MHC, el péptido puede reconocerse por una célula T (por medio del receptor de células T

(TCR) ) , en cuyo caso el péptido es un epítopo de célula T.

Los epítopos de células T desempeñan un papel fundamental en la respuesta inmunitaria adaptativa frente a cualquier antígeno, ya sea propio o extraño. El papel fundamental desempeñado por los epítopos de células T en enfermedades de hipersensibilidad (que incluyen alergia, enfermedades autoinmunitarias y rechazo de trasplante) se 20 ha demostrado a través de la utilización de modelos experimentales. Es posible inducir enfermedades inflamatorias o alérgicas mediante inyección de péptidos sintéticos (basados en la estructura de epítopos de células T) en combinación con un adyuvante.

Por el contrario, se ha demostrado que es posible inducir tolerancia inmunológica frente a epítopos peptídicos particulares mediante la administración de epítopos peptídicos en forma soluble. Se ha demostrado que la administración de antígenos peptídicos solubles es un medio eficaz para inhibir la enfermedad en la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE - un modelo para la esclerosis múltiple (EM) ) (Metzler y Wraith (1993) Int. Immunol. 5:1159-1165; Liu y Wraith (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; Anderton y Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251-1261) ; y modelos experimentales de artritis, diabetes y uveorretinitis (revisado en Anderton y Wraith (1998)

tal como anteriormente) . También se ha demostrado que esto es un medio para tratar una enfermedad en curso en EAE (Anderton y Wraith (1998) tal como anteriormente) .

La utilización de péptidos tolerogénicos para tratar o prevenir la enfermedad ha atraído una atención considerable. Una razón para esto es que se ha demostrado que ciertos epítopos tolerogénicos pueden regular por disminución respuestas de células T para distintos antígenos dentro del mismo tejido. Este fenómeno, conocido como "supresión transeúnte" significa que debería ser posible inducir tolerancia a más de un epítopo (preferentemente todos los epítopos) dentro de un antígeno dado y a más de un antígeno para una enfermedad dada, utilizando un péptido tolerogénico particular (Anderton y Wraith (1998) tal como anteriormente) . Esto obviaría la necesidad de identificar todos los antígenos patógenos dentro de una enfermedad particular.

Los péptidos son también una opción favorable para el tratamiento debido a su coste relativamente bajo y al hecho de que pueden producirse análogos peptídicos con propiedades inmunológicas alteradas. Los péptidos pueden modificarse por tanto para alterar sus interacciones o bien con MHC o TCR.

Un posible problema de este enfoque es que se ha demostrado que no todos los péptidos que actúan como epítopos de células T pueden inducir tolerancia. El péptido 89-101 proteína básica de la mielina (MBP) es un antígeno inmunodominante tras la inmunización y es también un inmunógeno muy eficaz en cuanto tanto a la sensibilización para la reactividad de células T como a la inducción de EAE. Sin embargo, se ha demostrado que este péptido es ineficaz para inducir tolerancia cuando se administra en disolución (Anderton y Wraith (1998) , tal como anterior

mente) .

Se han propuesto varias explicaciones para la jerarquía observada en la capacidad de los epítopos de células T para inducir tolerancia (revisado en Anderton y Wraith (1998) tal como anteriormente) . En particular, se ha propuesto que existe una correlación entre la afinidad del péptido por el MHC y tolerogenicidad (Liu y Wraith (1995) tal como 55 anteriormente) , pero esto no concuerda con algunas de las observaciones. Por ejemplo, MBP [89-101], que no es tolerogénica, se une a I-As con una afinidad relativamente alta. Por tanto no es sencillo predecir qué péptidos inducirán tolerancia.

Wicker et al. (1996) J. Clin. Invest. 98:2597-2653, divulgan un método para identificar epítopos peptídicos de unión 60 de clase II a partir de antígenos relacionados con enfermedades autoinmunitarias en el desarrollo de terapia de modulación inmunitaria específica de antígeno.

Fairchild et al. (1996) , International Immunity, 8:1035-1043, describen el uso de un sistema de presentación de antígenos libre de transformación para investigar el efecto de incrementar longitud peptídica por encima del epítopo 65 de células T mínimo.

Si existiera una explicación de porqué solamente una proporción de los epítopos peptídicos pueden inducir tolerancia, esto facilitaría la selección de péptidos tolerogénicos útiles en el tratamiento y la prevención de trastornos de hipersensibilidad.

Sumario de la invención Los autores de la presente invención han demostrado que si un epítopo peptídico presenta un tamaño apropiado para presentarse por APC inmaduras sin transformación antigénica, ello puede inducir tolerancia inmunológica. La observación de que algunos epítopos de células T son tolerogénicos y otros no pueden inducir tolerancia puede explicarse por tanto por el hecho de que algunos epítopos requieren transformación adicional antes de que puedan presentarse por una molécula del MHC. Estos epítopos que requieren transformación adicional no inducen tolerancia cuando se administran en una forma soluble, a pesar de su capacidad para inducir enfermedad cuando se inyectan en combinación con adyuvante.

Los epítopos que no requieren transformación adicional pueden inducir tolerancia y se han denominado "apítopos" (Antigen Processing Independent epiTOPES) en la presente invención.

Este hallazgo proporciona un método basado en las reglas para la selección de epítopos de células T tolerogénicos que obvia la necesidad de examinar la capacidad tolerogénica de un péptido in vivo. Esto es particularmente ventajoso en el desarrollo de estrategias para tratar o prevenir enfermedades para las que no hay disponible ningún modelo animal. Incluso para enfermedades que presentan un modelo animal, el método de selección debería hacer más sencillo y seguro el desarrollo de composiciones de inducción de tolerancia, debido a que proporciona un mecanismo mediante el que la capacidad de inducción de tolerancia de un péptido puede someterse a prueba en células T humanas (antígeno de reconocimiento junto con moléculas del MHC humanas) in vitro, antes de su utilización in vivo.

En un primer aspecto, por lo tanto, la presente invención proporciona un método in vitro para seleccionar un péptido que sea útil en la prevención y/o el tratamiento de un trastorno de hipersensibilidad mediado por células T que reconozca el antígeno objetivo, que comprende las siguientes etapas:

(i) tratar un sistema de presentación de antígenos libre de transformación con una pluralidad de péptidos comprendiendo cada uno un epítopo de células T del antígeno diana;

(ii) analizar unión de los péptidos a moléculas del MHC de clase I o de clase II en el sistema añadiendo células T y 35 midiendo activación de células T;

(iii) identificar un péptido que es capaz de unir una molécula del MHC de clase I o de clase II en el sistema de presentación de antígenos libre de transformación y que se presenta a una célula T como siendo un péptido capaz de inducir tolerancia al antígeno diana in vivo cuando se administra a un sujeto, que es útil en la prevención y/o el tratamiento del trastorno de hipersensibilidad; y

(iv) seleccionar un péptido que se identifica como que es capaz de unir una molécula del MHC de clase I o de clase II en el sistema de presentación de antígenos libre de transformación y que se presenta a una célula T en la etapa (iii) .

En una realización preferida, el método comprende la etapa de investigar si el péptido es capaz de unión a una molécula del MHC de clase II en el sistema de presentación de antígenos libre de transformación y de presentación a una célula T.

El péptido seleccionado por el método de la invención puede ser útil en el tratamiento y/o prevención de una... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para seleccionar un péptido que es útil en la prevención y/o tratamiento de un trastorno de hipersensibilidad mediado por células T que reconocen el antígeno diana, que comprende las siguientes etapas: 5

(i) tratar un sistema de presentación de antígenos libre de transformación con una pluralidad de péptidos comprendiendo cada uno un epítopo de células T del antígeno diana;

(ii) analizar unión de los péptidos a moléculas del MHC de clase I o de clase II en el sistema añadiendo células T y 10 midiendo activación de células T;

(iii) identificar un péptido que es capaz de unir una molécula del MHC de clase I o de clase II en el sistema de presentación de antígenos libre de transformación y que se presenta a una célula T como siendo un péptido capaz de inducir tolerancia al antígeno diana in vivo cuando se administra a un sujeto, que es útil en la prevención y/o el

tratamiento del trastorno de hipersensibilidad; y

(iv) seleccionar un péptido que se identifica como que es capaz de unir una molécula del MHC de clase I o de clase II en el sistema de presentación de antígenos libre de transformación y que se presenta a una célula T en la etapa (iii) .

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sistema de presentación de antígenos comprende:

(i) células presentadoras de antígeno fijadas; 25 (ii) membranas lipídicas que comprenden moléculas del MHC de clase I o de clase II; o (iii) moléculas del MHC de clase I o de clase II unidas a placa.

3. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende la etapa de investigar si el

péptido es capaz de unión a una molécula del MHC de clase II en el sistema de presentación libre de transformación y que se presenta a una célula T.

4. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la pluralidad de péptidos se eluye a partir de las moléculas del MHC de clase II de una célula presentadora de antígeno. 35

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el péptido se selecciona a partir de un conjunto jerarquizado de péptidos truncados.

6. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la presencia de un epítopo de células T 40 en el péptido se determina por:

(i) tratar:

una muestra de células de un sujeto que tiene la enfermedad, y 45 una muestra de células de un sujeto que no tiene la enfermedad con el péptido; y

(ii) comparar las respuestas de células T entre las muestras celulares.

7. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el trastorno de hipersensibilidad es alergia, enfermedad autoinmunitaria o rechazo de injerto.

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