Método de identificación de variabilidad inducida en cultivos in vitro.

Uso de la técnica de AFLP que se compone de las etapas: aislar ADN genómico,

digerir el ADN genómico con un par de endonucleasas de restricción y digerir otra parte del mismo ADN con otro par de endonucleasas de restricción, hibridar heterodúplex sintéticos a los extremos de restricción libres, amplificar inicialmente los fragmentos obtenidos de tal manera por medio de PCR primaria, amplificar selectivamente, separar los productos de PCR en un gel de poliacrilamida, realizar un análisis de perfil visual para el método para la identificación de variabilidad inducida por el método de derivación en cultivos in vitro a nivel de plantas regenerantes, así como la variación heredada como resultado de propagación generativa que consiste en las siguientes etapas:

1) estimar la repetibilidad de las dos variantes de la técnica de AFLP: controlar la repetibilidad de AFLP basado en la identidad de varias muestras de ADN de la misma planta a través del uso de AFLP e isoesquizómeros tanto sensibles como insensibles a la metilación en el sitio de restricción y/o zonas adyacentes así como un número representativo de pares de cebadores selectivos idénticos en todos los 15 análisis de AFLP.

Método de identificación de variabilidad inducida en cultivos in vitro

Campo de la invención El objeto de la presente invención es el uso de la técnica de AFLP que se compone de las etapas: aislar ADN genómico, digerir el ADN genómico con un par de endonucleasas de restricción y digerir otra parte del mismo ADN con otro par de endonucleasas de restricción, hibridar heterodúplex sintéticos a los extremos de restricción libres, amplificar inicialmente los fragmentos obtenidos de tal manera por medio de PCR primaria, amplificar selectivamente, separar los productos de PCR en un gel de poliacrilamida, realizar un análisis de perfil visual para el método para la identificación de variabilidad inducida por el método de derivación en cultivos in vitro Es un fenómeno bien establecido que, tras la regeneración de plantas a partir de tejido no diferenciado, la población resultante de individuos clonales no es fenotípica o geneticámente homogénea. Ambos acontecimientos somaclonal y gametoclonal contribuyen a esta variación inducida en cultivo tisular. El término variación somaclonal lo introdujeron Larkin y Scowcroft [Larkin y Scowcroft 1981] para describir la variación que surge durante el cultivo de células somáticas, mientras que la variación gametoclonal representa la variación heredable que surge durante el cultivo de células de origen gamético. La base genética que subyace a la variación somaclonal sigue siendo controvertida [Bouman y De Klerk 2001, Bregitzer, et al. 1998, Fourré, et al. 1997, Hossain, et al. 2003, Linacero, et al. 2000, Munthali, et al. 1996] y tanto los mecanismos mediante los que se induce, como las maneras en que puede detectarse y aprovecharse se han comentado ampliamente en la bibliografía [Brar y Jain 1998, Remotti 1998]. Los acontecimientos genéticos (mutagénesis puntual de ADN, amplificación de secuencias de microsatélites [Linacero, et al. 2000] y movimiento del transpón (Peshke y Phillips 1991] y epigenéticos (cambios localizados en el estado de metilación del ADN (Jaligot, et al. 2002, Jaligot, et al. 2000) ) ) proporciona una ruta molecular para su inducción. Se acepta en general que los sistemas in vitro que requieren un paso prolongado a través de una fase de callo o suspensión celular son los más vulnerables a la mutación (Arene, et al. 1993, Freyssinet y Freyssinet 1988, Roseland, et al. 1991, Thomas, et al. 1982) , y por tanto se ha sugerido que el medio más eficaz de minimización de la variación es intentar inducir embriogénesis somática lo más rápidamente posible (Gray, et al. 1995) . La definición de los cambios moleculares que subyacen a la variación somaclonal de novo y la cuantificación de su frecuencia se han visto impedidas por dificultades metodológicas (Gaj 2001) , y esto se refleja en la descripción limitada de esta variación (principalmente a nivel fenotípico) en la bibliografía (Guzy-Wróblewska y Szarejko 2003) . Sin embargo, no puede tomarse una falta de cambios detectables visualmente para deducir una falta de variación a nivel molecular (Gaj 2001) .

La tecnología de huella dactilar de ADN tiene el potencial de detectar cambios del ADN con precisión y eficacia crecientes. Sin embargo, ni los enfoques basados en RFLP ni los basados en RAPD han sido particularmente satisfactorios en el reconocimiento de variantes somaclonales (Devaux, et al. 1993) . Munthali et al. (Munthali, et al. 1996) identificaron sólo tres variantes de 5607 productos de RAPD entre un conjunto de plantas de remolacha regeneradas, y se observó una frecuencia similarmente baja en Begonia (Bouman y De Klerk 2001) . Se han logrado resultados algo mejores en estudios de regenerantes de Lolium derivados de protoplastos (Wang, et al. 1993) , y a partir de suspensiones de cultivo celular de trigo a largo plazo (Brown, et al. 1993) . La técnica de AFLP es potencialmente más apropiada como plataforma de detección, puesto que tanto identifica un número relativamente grande de fragmentos amplificados, como es más robusta experimentalmente que RAPD, como resultado de su uso de un régimen de PCR más riguroso. A pesar de esto, hasta la fecha se han publicado relativamente pocos informes de su uso para detectar variación en el patrón de metilación o la variación somaclonal (Cervera, et al. 2002, Portis, et al. 2003, Vendrame, et al. 1999) . Como ejemplo, pudo discriminar de manera inequívoca entre líneas de cultivo embriogénicas de Car y a illinoinensis y pudo agrupar los embriones que se originaban a partir de una línea dada (Vendrame, et al. 1999) .

Una característica de AFLP es la flexibilidad de elección para las dos enzimas de restricción necesarias para la digestión inicial del ADN molde. Cuando una o ambas son sensibles a la metilación, la pérdida o ganancia de fragmentos en un perfil puede deberse o bien a la ganancia/pérdida de sitios de restricción (variantes de secuencia)

o a la metilación diferencial de sitios de reconocimiento particulares, tal como señalaron Donini et al. (Donini, et al. 1997) . Se han explorado comparaciones isoesquizoméricas, en las que un tratamiento usa una enzima sensible a la metilación, y el otro una insensible a la metilación en Arabidopsis (Cervera, et al. 2002) . Este método, denominado polimorfismo amplificado sensible a la metilación (MSAP, methylation sensitive amplified polymorphism) , es particularmente adecuado para el análisis de la base molecular de la variación somaclonal. El presente estudio describe la elaboración y aplicación de un método analítico, que permite la detección de variación inducida en cultivo tisular en cebada (Hordeum vulgare L.) tanto a nivel de la secuencia de nucleótidos como de metilación de ADN. El objetivo era comparar adicionalmente la frecuencia y los patrones de variación entre dos fuentes diferentes de explantes (embriones inmaduros y microsporas) y evaluar el potencial del enfoque para cuantificar las contribuciones de metilación y la alteración de secuencia con respecto a la variación global. Se propone un método lo suficientemente flexible para estudiar diferente partes del genoma, y adaptado para proporcionar una descripción o bien cualitativa o bien cuantitativa de la variación inducida en cultivo tisular.

La descripción de patente US6300071 (publicada el ) describe un método para detectar la metilación de ácido nucleico usando AFLP (TM) . La invención se refiere a un método para analizar la determinación del patrón de metilación de un ADN de partida y/o para distinguir entre sitios metilados y no metilados en el ADN de partida, que comprende al menos (A) generar una primera huella dactilar de ADN, que contiene bandas correspondientes a tanto los sitios metilados como no metilados de interés; y/o (B) generar una segunda huella dactilar de ADN, que contiene bandas correspondientes sólo a los sitios metilados de interés; y que comprende opcionalmente (C) generar una tercera huella dactilar de ADN, que contiene bandas correspondientes sólo a los sitios no metilados de interés; y que comprende además opcionalmente (D) analizar la (s) huella (s) dactilar (es) así obtenido (s) . Las huellas dactilares se generan preferiblemente usando AFLP, por medio de una cortadora frecuente y una cortadora inusual sensible a la metilación. La invención se refiere además a métodos para específicos generar la primera y la segunda huellas dactilares de ADN anteriores por medio de AFLP, y a kits para uso con dichos métodos.

La descripción de patente WO9953100 (publicada el ) describe un método para hallar marcadores genéticos de la variación somaclonal. La invención proporciona un método para obtener marcadores moleculares para su uso como herramienta de control de calidad y de diágnostico para identificar polimorfismos genómicos que surgen durante el proceso de cultivo tisular de plantas propagadas in vitro. Usando un análisis de representación de diferencias (RDA) adaptado para genomas de plantas, se obtiene un conjunto de secuencias con diferencias de ácido nucleico entre genomas de plantas normales y fuera de tipo. La invención proporciona además un método para aislar conjuntos de secuencias variantes que son comunes para muchas plantas fuera de tipo generadas en cultivo tisular o que se producen de manera natural del mismo cultivar o especie, además de secuencias variantes presentes en todas las plantas fuera de tipo, independientemente de la mutación fenotípica, y/o en todas las plantas fuera de tipo que presentan la misma mutación. La detección de la variación somaclonal mediante el método de la invención puede presentar una oportunidad para optimizar las condiciones de cultivo tisular y para optimizar las tasas de multiplicación de plantas sin producir un número significativo de plantas fuera de tipo.

A pesar de la investigación mencionada... [Seguir leyendo]

1. Uso de la técnica de AFLP que se compone de las etapas: aislar ADN genómico, digerir el ADN genómico con un par de endonucleasas de restricción y digerir otra parte del mismo ADN con otro par de endonucleasas de restricción, hibridar heterodúplex sintéticos a los extremos de restricción libres, amplificar inicialmente los fragmentos obtenidos de tal manera por medio de PCR primaria, amplificar selectivamente, separar los productos de PCR en un gel de poliacrilamida, realizar un análisis de perfil visual para el método para la identificación de variabilidad inducida por el método de derivación en cultivos in vitro a nivel de plantas regenerantes, así como la variación heredada como resultado de propagación generativa que consiste en las siguientes etapas:

1) estimar la repetibilidad de las dos variantes de la técnica de AFLP: controlar la repetibilidad de AFLP basado en la identidad de varias muestras de ADN de la misma planta a través del uso de AFLP e isoesquizómeros tanto sensibles como insensibles a la metilación en el sitio de restricción y/o zonas adyacentes así como un número representativo de pares de cebadores selectivos idénticos en todos los análisis de AFLP;

2) estimar la repetibilidad de las dos variantes de la técnica de AFLP: controlar la repetibilidad de AFLP basado en la identidad de varias muestras de ADN de la misma planta a través del uso de AFLP e isoesquizómeros tanto sensibles como insensibles a la metilación en el sitio de restricción y/o zonas adyacentes así como un número representativo de pares de cebadores selectivos usando un conjunto diferente de cebadores de AFLP selectivos a los usados en los demás análisis de AFLP;

3) identificar la variabilidad inducida por el método de derivación de los regenerantes en relación con la planta donante, lo que se realiza en dos variantes de AFLP usando isoesquizómeros tanto sensibles como insensibles a la metilación en el sitio de restricción y/o zonas adyacentes así como un número representativo de pares de cebadores selectivos idénticos en todos los análisis de AFLP;

4) identificar la variabilidad inducida en cultivo tisular entre los regenerantes en relación con la planta donante, lo que se realiza en dos variantes de la técnica de AFLP utilizando isoesquizómeros tanto sensibles como insensibles a la metilación en el sitio de restricción y/o zonas adyacentes así como un número representativo de pares de cebadores selectivos idénticos en todos los análisis de AFLP;

5) identificar la variabilidad somaclonal entre la progenie de regenerantes en relación con la planta donante, lo que se lleva a cabo usando dos variantes de la técnica de AFLP utilizando isoesquizómeros tanto sensibles como insensibles a la metilación en el sitio de restricción y/o zonas adyacentes así como un número representativo de pares de cebadores selectivos idénticos en todos los análisis de AFLP;

6) realizar el análisis molecular del material experimental usando la técnica de AFLP teniendo en cuenta isoesquizómeros tanto sensibles como insensibles a la metilación en el sitio de restricción y/o zonas adyacentes así como un número representativo de pares de cebadores selectivos idénticos en todos los análisis de AFLP, que se compone de las siguientes etapas:

a) realizar análisis de patrones de AFLP de plantas donantes con respecto a la variabilidad genética y epigenética inducida durante la propagación generativa de una planta individual, un control de la propagación generativa,

b) realizar análisis de patrones de AFLP para el control de la reproducibilidad de ambas variantes de la técnica de AFLP,

c) realizar un análisis de patrones de AFLP para los regenerantes en comparación con plantas donantes o regenerantes separados en relación con plantas donantes apropiadas;

d) realizar análisis de patrones de AFLP para la planta donante, su regenerante y la progenie de regenerantes, o las distintas líneas de progenie de regenerantes junto con la planta donante apropiada y sus plantas regenerantes;

7) identificar los 14 tipos de acontecimientos reconocidos a nivel de la matriz binaria para sistemas sensibles e insensibles a la metilación, que son el resultado de una comparación entre la planta donante con los regenerantes y entre la planta donante con la progenie de regenerantes simultáneamente en dos sistemas de AFLP, en el que se lleva a cabo la identificación de tipos de acontecimiento individualmente para cada regenerante y en masa para progenies de regenerantes y se representa como 14 matrices binarias que describen cada uno de los acontecimientos independientemente, subdivididos en métodos de derivación; en el que las columnas representan regenerantes consecutivos o masas y las filas representan fragmentos de AFLP consecutivos;

8) asignar determinados tipos de acontecimiento a un tipo dado de variabilidad inducida el método de derivación en relación con cada regenerante;

9) identificar los 14 tipos de acontecimientos reconocidos a nivel de la matriz binaria para sistemas sensibles e insensibles a la metilación, que son el resultado de una comparación entre la planta donante con regenerante simultáneamente en dos sistemas de AFLP;

10) identificar los 14 tipos de acontecimientos reconocidos a nivel de la matriz binaria para sistemas sensibles e insensibles a la metilación, que son el resultado de una comparación entre la planta donante con la progenie de regenerantes simultáneamente en dos sistemas de AFLP, en el que se realiza la identificación de tipos de acontecimiento a través de la suma de los genotipos de una progenie resumen dada, y a través de la comparación de un perfil de AFLP total de este tipo de la progenie de regenerantes con el perfil de la planta donante,

11) el genotipo de la progenie de regenerantes en masa expresado mediante un perfil de AFLP para sistemas sensibles e insensibles a la metilación a nivel de fragmentos de AFLP individuales tiene un valor diferente del de la planta donante en un sistema de AFLP dado, siempre que un fragmento dado dentro del mismo sea polimórfico, o es totalmente diferente de este valor para la planta donante; en el caso opuesto, los valores para la planta donante y la progenie de regenerantes en masa para un fragmento de AFLP dado en un sistema de AFLP dado son idénticos,

12) producir una matriz cuantitativa para los regenerantes, en la que las columnas contienen datos para regenerantes consecutivos agrupados mediante el método de derivación, y las filas contienen los 14 tipos de acontecimientos que pueden asignarse a cada progenie de regenerantes;

13) producir una matriz cuantitativa para la progenie de regenerantes, en la que las columnas contienen datos en masa para la progenie de regenerantes agrupados mediante el método de derivación, y las filas contienen los 14 tipos de acontecimientos que pueden asignarse a cada progenie de regenerantes en masa;

14) producir una matriz cuantitativa para los acontecimientos en regenerantes, siendo ésta una matriz cuantitativa para los regenerantes tras la transposición, en la que las columnas contienen 14 acontecimientos y las filas contienen regenerantes agrupados mediante el método de derivación;

15) calcular el número total de acontecimientos basado en la matriz binaria para métodos individuales de derivación de regenerantes así como para los regenerantes, calculándose el número total de acontecimientos como un producto del número de fragmentos de AFLP identificados en ambos sistemas de AFLP para todos los pares de cebadores selectivos multiplicado por el número de regenerantes derivados mediante un método dado;

16) calcular el número total de acontecimientos basado en la matriz binaria para métodos individuales de derivación de regenerantes así como para progenies de regenerantes en masa, correspondiendo el número total de acontecimientos al número de fragmentos de ADN idénticos o diferentes en ambos sistemas de AFLP para todos los pares de cebadores selectivos usados en el análisis;

17) calcular el error que se origina de la propagación generativa, lo que se lleva a cabo basado en la matriz binaria de plantas donantes y una única planta; determinar el número de acontecimientos diferentes de aquéllos en una única planta perteneciente a las plantas donantes, y calcular el número total de acontecimientos para la planta donantes;

18) calcular el error que se origina de la de la técnica de AFLP, lo que se lleva a cabo basándose en la matriz binaria para muestras de ADN obtenidas de la misma planta y sometidas a las etapas de la técnica de AFLP usando isoesquizómeros sensibles e insensibles a la metilación en el sitio de restricción o sus alrededores inmediatos así como un número representativo de pares de iniciadores selectivos idénticos en todos los sistemas de AFLP, calculándose el número total de acontecimientos y el número de acontecimientos polimórficos, y se expresa este último número como porcentaje;

19) determinar, basado en matrices binarias para los regenerantes y la planta donante, grupos de acontecimientos que describen: (a) la variación de secuencia relacionada con cualquier cambio en las secuencias de nucleótidos del ADN basado en datos de AFLP del sistema insensible a la metilación y (b) la variabilidad epigenética, la variabilidad de novo de patrones de metilación, y adicionalmente la variación mixta que es variabilidad de secuencia y metilación basado en datos para ambos sistemas de AFLP;

20) determinar, basado en matrices binarias para la progenie de regenerantes en masa y la planta donante, grupos de acontecimientos que describen (a) la variación de secuencia relacionada con todos los cambios de nucleótidos del ADN basado en datos de AFLP del sistema insensible a la metilación y (b) la variabilidad epigenética, la variabilidad de novo de patrones de metilación, y adicionalmente la variación mixta que es variabilidad de secuencia y metilación, y (c) la herencia de patrones de metilación tal como se relaciona con la presencia y/o falta de metilación en el sitio de restricción o sus proximidades, basado en datos para ambos sistemas de AFLP;

21) identificar acontecimientos particularmente sometidos a la actividad de factores que inducen la variabilidad en cultivos in vitro;

22) realizar el análisis de secuencia de tipos individuales de acontecimiento y/o amplia variabilidad de secuencia, identificándose la variabilidad usando variantes de la técnica de AFLP usando cebadores dirigidos contra secuencias conservativas dentro de elementos móviles, secuencias de repetición o las secuencias de familias génicas conservativas;

23) realizar un análisis estadístico de la planta donante y sus regenerantes así como la progenie de regenerantes, y posiblemente distintos regenerantes y progenies de regenerantes junto con plantas donantes apropiadas, así como el control de la reproducción de AFLP y el control de la propagación generativa:

a) realizar un análisis estadístico de los resultados de AFLP usando análisis paramétrico, la prueba de Mantel y/o el coeficiente alfa de Cronbach así como análisis de la varianza molecular usando los coeficientes Fs o Phis;

b) determinar el error de las estimaciones de variabilidad somaclonal e inducida en cultivo tisular, basado en el coeficiente de correlación de la prueba de Mantel;

c) determinar los parámetros cuantitativos de la variabilidad inducida por el método de derivación de regenerantes y la variabilidad somaclonal para los regenerantes, progenies individuales de regenerantes, teniendo en cuenta el método de derivación y proporcionando su nivel de signficación estadística;

d) determinar estadísticamente las diferencias entre tipos individuales de acontecimientos inducidos en cultivos in vitro para los regenerantes, así como la progenie de regenerantes en masa, agrupados mediante un método de derivación y complementados mediante su signficación estadística usando matrices cuantitativas de acontecimientos;

e) realizar un análisis estadístico de la comparación entre la variabilidad inducida por el método de derivación así como la variación somaclonal, determinado a través de la comparación del perfil de la planta donante, y el perfil en masa de la progenie de regenerantes y sus tipos: variabilidad de secuencia y/o amplia variabilidad de secuencia, metilación de novo, desmetilación, variabilidad mixta, herencia de: patrones de metilación, sitios no metilados o sitios conservativos en la progenie de regenerantes, agrupados mediante un método de derivación así como una comparación por método de derivación de la progenie de regenerantes, cuando se usan matrices cuantitativas para los acontecimientos;

f) realizar comparaciones estadísticas de regenerantes, y las progenies de regenerantes en masa para diferentes métodos de derivación para una progenie de regenerantes dada, cuando se usan matrices cuantitativas de la progenie;

g) realizar una comparación estadística de los resultados de los puntos mencionados anteriormente para regenerantes individuales y progenies de regenerantes en masa entre sí;

h) realizar una comparación estadística o cualitativa de la variación somaclonal entre plantas individuales que son la progenie generativa de regenerantes;

i) recoger los resultados existentes en forma de una compilación que indica características cuantitativas de variabilidad inducida por el método de derivación determinado a nivel del regenerante, así como características cuantitativas de variabilidad heredada determinada a nivel de la progenie de regenerantes.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la identificación de los 14 tipos de acontecimientos reconocidos a nivel de la matriz binaria se selecciona de los acontecimientos representados en la figura 7.

3. Uso según la reivindicación 1, en el que para derivar plantas donantes, se usa una única planta que es un haploide duplicado derivado de una microspora aislada, en el que se trata como control de la variabilidad genética y epigenética de plantas donantes.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que la variabilidad genética y epigenética de material propagado de manera generativa, plantas donantes, se determina basado en perfiles de AFLP obtenidos de isoesquizómeros de endonucleasas de restricción que reconocen y que digieren secuencias idénticas, pero

que difieren en su sensibilidad a la metilación en o alrededor del sitio de restricción, en el que uno de los isoesquizómeros es insensible a la metilación.

5. Uso según la reivindicación 1, en el que en un sistema sensible e insensible a la metilación no se observan diferencias en los perfiles de AFLP de plantas donantes, entonces es insignificante el nivel de variabilidad inducida a través de propagación generativa e identificado con un par dado de cebadores selectivos.

6. Uso según la reivindicación 1, en el que cuando existen diferencias en los perfiles de AFLP para plantas donantes entre un sistema sensible y un sistema insensible a la metilación, se determina una parte porcentual de un acontecimiento de este tipo, junto con el nivel de fondo, el error de propagación generativa.

7. Uso según la reivindicación 1, en el que cuando existen diferencias en los perfiles de AFLP para replicantes experimentales en las mismas muestras de ADN, se estima el error de la técnica de AFLP con el fin de determinar el error experimental.

8. Uso según la reivindicación 1, en el que la parte integral del material de investigación se compone de plantas donantes, junto con una única planta, los regenerantes de la planta donante y progenies de regenerantes separadas.

9. Uso según la reivindicación 1, en el que la planta donante junto con los regenerantes y la progenie de regenerantes componen el núcleo de material de investigación para el estudio de la variabilidad inducida por el método de derivación o la variabilidad somaclonal, respectivamente.

10. Uso según la reivindicación 1, en el que se realiza el análisis molecular usando la técnica de AFLP en dos variantes, usando isoesquizómeros que difieren en su sensibilidad a la metilación.

11. Uso según la reivindicación 1, en el que uno de los isoesquizómeros es completamente insensible a la metilación.

12. Uso según la reivindicación 1, en el que en la identificación de productos de PCR segregados se usa un marcador isotópico que se introduce en el extremo 5” del cebador complementario al adaptor hibridado al sitio de restricción liberado por los isoesquizómeros.

13. Uso según la reivindicación 1, en el que se usan otros métodos de visualización de fragmentos de AFLP, incluyendo fluorescencia.

14. Uso según la reivindicación 1, en el que se realizan los perfiles de ambas variantes de AFLP para la planta donante junto con sus regenerantes y teniendo en cuenta el método de derivación y el control de la reproducibilidad de AFLP, con pares de cebadores de AFLP idénticos.

15. Uso según la reivindicación 1, en el que el análisis del perfil de AFLP y su conversión en matrices binarias se basa en el hecho de que los perfiles de AFLP de ambos sistemas de restrictasas para todos los pares de cebadores selectivos se introducen como una matriz binaria en una hoja de cálculo, en el que el conjunto de datos obtenido para un par de cebadores de AFLP selectivos se coloca bajo el anterior de manera que cada columna representa un perfil binario total para una planta donante en un sistema de AFLP, y las columnas posteriores contienen datos análogos para los regenerantes y los controles, en el que se registran datos para el segundo sistema de AFLP en columnas posteriores, en el que se ordenan las bandas de un sistema como las del sistema anterior (en filas) , y cuando no aparece una banda dada, se introduce un cero en la fila apropiada de la hoja de cálculo.

16. Uso según la reivindicación 1, en el que el análisis del perfil de AFLP y su conversión en matrices binarias se basa en el hecho de que los perfiles de AFLP de ambos sistemas de restrictasas para todos los pares de cebadores selectivos se introducen como una matriz binaria en una hoja de cálculo, en el que el conjunto de datos obtenido para un par de cebadores de AFLP selectivos se coloca bajo el anterior de manera que cada columna representa un perfil binario total para una planta donante en un sistema de AFLP, y las columnas posteriores contienen datos análogos para progenies de regenerantes y los controles, en el que se registran datos para el segundo sistema de AFLP en columnas posteriores, en el que se ordenan las bandas de un sistema como las del sistema anterior (en filas) , y cuando no aparece una banda dada, se introduce un cero en la fila apropiada de la hoja de cálculo.

17. Uso según la reivindicación 1, en el que el perfil de AFLP para la progenie de regenerantes se representa en forma de un genotipo en masa por variante de AFLP, sensible e insensible a la metilación por separado.

18. Uso según la reivindicación 1, en el que se lleva a cabo el control de la propagación generativa a través de la suma del número de señales (acontecimientos) de una única planta, en el que se calcula el número de

cambios como un porcentaje del número total de acontecimientos.

19. Uso según la reivindicación 1, en el que se realizan el análisis paramétrico, el análisis de correlación mediante la prueba de Mantel y el análisis de variabilidad molecular usando matrices binarias de sistemas de AFLP sensibles e insensibles a la metilación para los regenerantes y/o la progenie de regenerantes dependiendo de si está analizándose la variabilidad inducida en cultivo o heredada por la progenie de regenerantes.

20. Uso según la reivindicación 1, en el que se usa el análisis factorial como la representación gráfica de los resultados de AFLP.

21. Uso según la reivindicación 1, en el que la identificación de los 14 tipos de acontecimientos reconocidos a nivel del patrón de AFLP y asignados a la variabilidad inducida por el método de derivación se realiza basándose en patrones de AFLP, en el que se usa el perfil de la planta donante junto con perfiles de regenerante en ambos sistemas, y posteriormente se compara el perfil de cada regenerante con el perfil de la planta donante con el fin de identificar estos acontecimientos.

22. Uso según la reivindicación 1, en el que la identificación de los 14 tipos de acontecimientos reconocidos a nivel de patrones de AFLP y asignados a la variabilidad somaclonal se lleva a cabo basándose en patrones de AFLP, en el que se usa el perfil de la planta donante junto con perfiles en ambos sistemas de AFLP, y el perfil en masa de la progenie de regenerantes se compara con el perfil de la planta donante con el fin de identificar tipos de acontecimiento, en el que se supone que en caso de fragmentos polimórficos de AFLP del genotipo de la progenie de regenerantes en masa, se introduce un valor diferente del de la planta donante o un valor diferente si es diferente del de la planta donante en todas las progenies de regenerantes para un sistema de AFLP dado.

23. Uso según la reivindicación 1, en el que cuando los 14 tipos de acontecimientos comprenden la base para su segregación en grupos: variabilidad de secuencia, variabilidad de metilación (metilación y desmetilación) , variabilidad mixta y herencia de patrones de metilación, en el que se tiene en cuenta que la variabilidad de secuencia se confirma de manera inequívoca en un sistema insensible a la metilación.

24. Uso según la reivindicación 1, en el que el análisis de la significación de acontecimientos y tipos de variabilidad independientes dentro de los regenerantes y la progenie de plantas regenerantes, tal como se agrupan mediante el método de derivación, se realiza basado en matrices cualitativas y matrices cuantitativas de acontecimientos que describen todos los acontecimientos teóricamente posibles, así como las plantas regenerantes y la progenie de regenerantes.

25. Uso según la reivindicación 1, en el que los resultados del análisis estadístico para regenerantes individuales y progenies de regenerantes en masa obtenidos a través de diversos medios se compilan en un todo; se introducen parámetros cuantitativos para la variabilidad inducida por el método de derivación y de la variabilidad somaclonal para regenerantes individuales y progenies de regenerantes en masa así como para progenies de regenerantes separadas agrupadas mediante el método de derivación y tipos de acontecimiento junto con parámetros estadísticos.

26. Uso según la reivindicación 1, en el que se identifican aquellos tipos de acontecimiento, que son poco comunes en cultivo o que no se producen en absoluto, así como aquéllos que están sometidos particularmente a la actividad de factores que inducen la variabilidad a nivel de regenerante y la progenie de regenerantes, así como para determinar sus parámetros cuantitativos.

27. Uso según la reivindicación 1, en el que se estudian tipos individuales de acontecimiento a nivel molecular a través del análisis de secuencia de fragmentos de AFLP que representan tipos individuales de acontecimientos, y por los mismos tipos de testigos de la variabilidad somaclonal.

28. Uso según la reivindicación 1, en el que se analiza una o más progenies de regenerantes en masa.

29. Uso según la reivindicación 1, en el que se proporcionan las características cuantitativas de un acontecimiento para cada progenie de regenerantes individual: variabilidad de secuencia, amplia variabilidad de secuencia, variabilidad epigenética de patrones de metilación (metilación de novo, desmetilación) , estabilidad de sitios metilados y no metilados heredados (conservativos) , frente a cambios inducidos en cultivos así como la introducción de diferencias cuantitativas en la variabilidad entre diferentes métodos de derivación de material de planta.

30. Uso según la reivindicación 1, en el que se realiza un análisis estadístico de la significación de tipos individuales de acontecimiento entre los regenerantes, la progenie de regenerantes en masa y progenies individuales de regenerantes según sea necesario, agrupados mediante el método de derivación del material de investigación.

31. Uso según la reivindicación 1, en el que se determina independientemente el nivel de en el que variabilidad somaclonal de plantas individuales que son la progenie de regenerantes, usando los principios usados para la variabilidad somaclonal.

32. Uso según la reivindicación 1, en el que se someten a prueba las hipótesis relacionadas con las fuentes de variabilidad inducida por el método de derivación de regenerantes y que se heredan como resultado de propagación generativa.

33. Uso según la reivindicación 1, en el que se realiza el análisis detallado de las causas de variabilidad de secuencia después de introducir cambios de procedimiento de AFLP menores, basado en la amplificación selectiva de material de investigación usando un cebador con etiqueta complementario a sitios conservativos de elementos transponibles, o a secuencias de macrosatélite.

34. Uso según la reivindicación 1, en el que se analiza la segregación de marcadores genéticos y epigenéticos para el mapeo de poblaciones derivadas a través de cruzamientos entre plantas que son la progenie de regenerantes con un genotipo conocido, basado en los perfiles de AFLP para ambos sistemas de AFLP.

35. Uso según la reivindicación 1, en el que el método está diseñado para derivar plantas in vitro con un nivel disminuido o potenciado de la variabilidad somaclonal a través de la identificación de las causas de esta variabilidad.

36. Uso según la reivindicación 1, en el que se verifica la pureza genética y epigenética de material arbitrario derivado a través de cultivo in vitro.

37. Uso según la reivindicación 1, en el que se usa el método en el análisis de la herencia de la variabilidad epigenética durante el cruzamiento sexual.

38. Uso según la reivindicación 1, en el que el método es una herramienta para la identificación de marcadores epigenéticos relacionados con las características utilitarias del material de planta.

39. Uso según la reivindicación 1, en el que se usa el método para la identificación de diferencias en patrones de metilación de ADN para diversos tejidos de una planta individual.