Método de determinación de la expresión génica del receptor del factor de crecimiento epidérmico y HER2-NEU y niveles de correlación de la misma con las tasas de supervivencia.

Método para determinar el nivel de expresión de EGFR en una muestra de tejido fijada incrustada en parafina,

pudiéndose usar dicho método para determinar un régimen quimioterápico que comprende:

(a) desparafinizar la muestra de tejido para obtener una muestra desparafinizada;

(b) aislar ARNm de la muestra desparafinizada mediante calentamiento en presencia de una cantidad eficaz de unagente caotrópico hasta una temperatura en el intervalo de 75 a aproximadamente 100ºC durante un periodo detiempo de aproximadamente a aproximadamente 120 minutos y recuperación de dicho ARNm de la disolucióncaotrópica;

(c) someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores oligonucleotídicos que consiste en un cebadoroligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 o una secuencia al menos el 80% idéntica a la misma,y un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:2 o una secuencia al menos el 80% idénticaa la misma para obtener una muestra amplificada; y

(d) determinar la cantidad de ARNm de EGFR en relación con la cantidad de ARNm de un gen de control interno.

Método de determinación de la expresión génica del receptor del factor de crecimiento epidérmico y her2-neu y niveles de correlación de la misma con las tasas de supervivencia Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos de pronóstico que son útiles en medicina, particularmente en quimioterapia del cáncer. Más particularmente, la invención se refiere a la evaluación de la capacidad de supervivencia de un paciente en el que se analiza la expresión génica de células tumorales. Adicionalmente, se somete a ensayo la sensibilidad de células tumorales a un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa examinando la expresión de ARNm

de los genes de EGFR y Her2-neu en seres humanos.

Antecedentes de la invención El cáncer de pulmón es la principal causa de muertes relacionadas con cáncer entre tanto hombres como mujeres en países occidentales. En los Estados Unidos, se diagnostican aproximadamente 171.000 nuevos casos de cáncer de pulmón y 160.000 individuos mueren de esta enfermedad cada año. A pesar de las mejoras en la detección y el trata15 miento del cáncer de pulmón en las últimas dos décadas, la supervivencia a 5 años global sigue siendo inferior al 15%. Ginsberg, et al., en: DeVita, et al., Cancer. Principles in Practice of Oncology, ed. 5, págs. 858-910. Filadelfia: Lipincott-Raven Publishers, 1997. Para mejorar adicionalmente la tasa de supervivencia en pacientes con carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , su clasificación de pronóstico basado en alteraciones moleculares es crucial. Tal clasificación proporcionará herramientas de diagnóstico más exactas y útiles y, finalmente, opciones terapéuticas más efi

caces.

El cáncer surge cuando una célula normal experimenta transformación neoplásica y se convierte en una célula maligna. Las células transformadas (malignas) escapan de los controles fisiológicos normales que especifican el fenotipo celular y restringen la proliferación celular. Por tanto, las células transformadas en el cuerpo de un individuo proliferan, formando un tumor. Cuando se encuentra un tumor, el objetivo clínico es destruir las células malignas selectivamente mientras que se mitiga cualquier daño provocado a células normales en el individuo que se somete a tratamiento.

La quimioterapia se basa en el uso de fármacos que son selectivamente tóxicos (citotóxicos) para células cancerosas. Se han desarrollado varias clases generales de fármacos quimioterápicos, incluyendo fármacos que interfieren con la síntesis de ácido nucleico, la síntesis de proteínas y otros procesos metabólicos vitales. Estos se denominan generalmente fármacos antimetabolitos. Otras clases de fármacos quimioterápicos infligen daño sobre el ADN celular. Los fármacos de estas clases se denominan generalmente genotóxicos. Adicionalmente, una clase de agentes quimioterápicos inhiben específicamente la señalización mitogénica a través de receptores tirosina cinasa (RTK) , en células en las que los RTK están sobreactivados. (Drugs of the Future, 1992, 17, 119) .

La susceptibilidad de un neoplasma individual a un fármaco quimioterápico deseado o una combinación de fármacos, sin embargo, puede evaluarse de manera exacta sólo tras un periodo de tratamiento de ensayo. El tiempo invertido en 35 un periodo de ensayo insatisfactorio representa un riesgo significativo en el manejo clínico de tumores malignos agresivos. Por tanto, es de importancia evaluar el estado de expresión de determinantes genéticos seleccionados como diana por agentes quimioterápicos específicos. Por ejemplo, si un tumor expresa altos niveles de genes de reparación del ADN, es probable que el tumor no responda bien a dosis bajas de agentes genotóxicos que dañan el ADN. Por tanto, el estado de expresión de determinantes genéticos de un tumor ayudará al médico a desarrollar un régimen quimioterápico apropiado específico para el repertorio genético del tumor.

Los receptores tirosina cinasa (RTK) son importantes en la transducción de señales mitogénicas. Los RTK son proteínas grandes que abarcan la membrana que tienen un dominio de unión a ligando extracelular para factores de crecimiento tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF) y una parte intracelular que funciona como cinasa para fosforilar residuos de aminoácido tirosina en proteínas del citosol mediando de ese modo la proliferación celular. Se conocen diver

sas clases de receptores tirosina cinasa basándose en las familias de factores de crecimiento que se unen a diferentes receptores tirosina cinasa. (Wilks, Advances in Cancer Research, 1993, 60, 43-73)

Las cinasas de clase I tales como la familia EGF-R de receptores tirosina cinasa incluyen los receptores de EGF, HER2neu, erbB, Xmrk, DER y let23. Estos receptores están presentes frecuentemente en cánceres humanos comunes tales como cáncer de mama (Sainsbur y et al., Brit. J. Cancer, 1988, 58, 458; Guerin et al., Oncogene Res., 1988, 3, 21) , 50 cáncer de células escamosas del pulmón (Hendler et al., Cancer Cells, 1989, 7, 347) , cáncer de vejiga (Neal et al., Lancet, 1985, 366) , cáncer de esófago (Mukaida et al, Cancer, 1991, 68, 142) , cáncer gastrointestinal tal como cáncer de colon, rectal o de estómago (Bolen et al., Oncogene Res., 1987, 1, 149) , leucemia (Konaka et al., Cell, 1984, 37, 1035) y cáncer de ovarios, bronquial o pancreático (memoria descriptiva de la patente europea n.º 0400586) . A medida que se someten a prueba tejidos tumorales humanos adicionales para detectar la familia de EGF de receptores tirosina cinasa,

se espera que su prevalencia extendida se establezca en otros cánceres tales como cáncer de tiroides y uterino.

Específicamente, la actividad EGFR tirosina cinasa raramente se detecta en células normales, mientras que puede detectarse más frecuentemente en células malignas (Hunter, Cell, 1987, 50, 823) . Se ha mostrado más recientemente que

EGFR se sobreexpresa en muchos cánceres humanos tales como tumores de cerebro, de células escamosas del pulmón, de vejiga, gástrico, de mama, de cabeza y cuello, esofágico, ginecológico y de tiroides. (W J Gullick, Brit. Med. Bull., 1991, 47, 87) . Los receptores tirosina cinasa también son importantes en otras enfermedades de proliferación celular tales como psoriasis. Los trastornos de EGFR son los caracterizados por expresión de EGFR por células que normalmente no expresan EGFR, o aumento de la activación de EGFR que conduce a proliferación celular no deseada, y/o la existencia de niveles de EGFR inapropiados. Se sabe que el EGFR se activa mediante su ligando EGF así como factor de crecimiento transformante-alfa (TGF-a) .

La proteína Her2-neu es también un miembro de la familia de receptores tirosina cinasa (RTK) de clase I. Yarden y Ullrich, Annu. Rev. Biochem. 57:443, 1988; Ullrich y Schlessinger, Cell 61:203, 1990. La proteína Her2-neu está estructuralmente relacionada con EGFR. Carraway, et al., Cell 78:5, 1994; Carraway, et al., J. Biol. Chem. 269:14303, 1994. Estos receptores comparten una arquitectura molecular común y contienen dos regiones ricas en cisteína dentro de sus dominios citoplasmáticos y regiones enzimáticas estructuralmente relacionadas dentro de sus dominios citoplasmáticos.

Se cree que la activación dependiente de ligando de la proteína Her2-neu está mediada por el factor de activación de neu (NAF) que puede unirse directamente a p165 (Her2-neu) y estimular la actividad enzimática. Dougall et al., Oncogene 9:2109, 1994; Samata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1711, 1994. La homodimerización independiente de ligando de la proteína Her2-neu y la activación del receptor resultante se ve facilitada por la sobreexpresión de la proteína Her2-neu. Un complejo de Her2-neu activado actúa como fosfocinasa y fosforila diferentes proteínas citoplasmáticas. Los trastornos de HER2-neu que se caracterizan por una actividad inapropiada o sobreactividad de HER2-neu tienen una expresión de HER2-neu aumentada que conduce a proliferación celular no deseada tal como cáncer.

Se emplean inhibidores de receptores tirosina cinasa EGFR y HER2-neu como inhibidores selectivos del crecimiento de células cancerosas de mamífero (Yaish et al. Science, 1988, 242, 933) . Por ejemplo, la erbstatina, un inhibidor del receptor tirosina cinasa de EGF, redujo el crecimiento de células de carcinoma mamario humano que expresan EGFR inyectadas en ratones desnudos atímicos, aunque no tuvo efecto sobre el crecimiento de tumores que no expresaban EGFR (Toi et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 1990, 26, 722) . También se establece que diversos derivados de estireno tienen propiedades inhibidoras de tirosina cinasas (solicitudes de patente europea n.os 0211363,... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar el nivel de expresión de EGFR en una muestra de tejido fijada incrustada en parafina, pudiéndose usar dicho método para determinar un régimen quimioterápico que comprende:

(a) desparafinizar la muestra de tejido para obtener una muestra desparafinizada;

(b) aislar ARNm de la muestra desparafinizada mediante calentamiento en presencia de una cantidad eficaz de un agente caotrópico hasta una temperatura en el intervalo de 75 a aproximadamente 100ºC durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 a aproximadamente 120 minutos y recuperación de dicho ARNm de la disolución caotrópica;

(c) someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores oligonucleotídicos que consiste en un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 o una secuencia al menos el 80% idéntica a la misma, y un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:2 o una secuencia al menos el 80% idéntica a la misma para obtener una muestra amplificada; y

(d) determinar la cantidad de ARNm de EGFR en relación con la cantidad de ARNm de un gen de control interno.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el par de cebadores oligonucleotídicos consiste en un oligonucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 y un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:2.

3. Método para determinar el nivel de expresión de HER2-neu en una muestra de tejido fijada incrustada en parafina, pudiéndose usar dicho método para determinar un régimen quimioterápico que comprende:

(a) desparafinizar la muestra de tejido para obtener una muestra desparafinizada;

(b) aislar ARNm de la muestra desparafinizada mediante calentamiento en presencia de una cantidad eficaz de un agente caotrópico hasta una temperatura en el intervalo de 75 a aproximadamente 100ºC durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 a aproximadamente 120 minutos y recuperación de dicho ARNm de la disolución caotrópica;

(c) someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores oligonucleotídicos que se hibridan en condiciones rigurosas con una región del gen HER2-neu que consiste en un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:4 o una secuencia al menos el 80% idéntica a la misma, y un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:5 o una secuencia al menos el 80% idéntica a la misma para obtener una muestra amplificada; y

(d) determinar la cantidad de ARNm de HER2-neu en relación con la cantidad de ARNm de un gen de control interno.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el par de cebadores oligonucleotídicos consiste en un oligonucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:4 y un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:5.

5. Método según la reivindicación 1 ó 3, en el que el gen de control interno es un gen de º-actina.