Método de detección clínica estandarizada del patógeno Acinetobacter baumannii.

La presente invención se encuentra dentro de la medicina y la biología molecular,

y se refiere al uso de una región en la determinación de bacterias del orden Pseudomonadales, y a un método específico, eficiente y validado, de alta repetitividad y reproducibilidad, que permite la detección estandarizada de distintas cepas del patógeno Acinetobacter baumannii en muestras clínicas que presentan una baja contaminación, pudiendo incluso detectar ADN libre, presente en el ambiente.

eMétodo de detección clínica estandarizada del patógeno Acinetobacter

baumannii.

La presente invención se encuentra dentro de la medicina y la biología molecular, y se refiere al uso de una región en la determinación de bacterias del orden Pseudomonadales, y a un método específico, eficiente y validado, de alta repetitividad y reproducibilidad, que permite la detección estandarizada de distintas cepas del patógeno Acinetobacter baumannii en muestras clínicas que presentan una baja contaminación, pudiendo incluso detectar ADN libre, presente en el ambiente.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Acinetobacter baumannii es un bacilo aerobio gram-negativo perteneciente al orden Pseudomonadales, con creciente importancia como agente causal de infecciones nosocomiales. La frecuencia de las infecciones causadas por A. baumannii ha aumentado de forma alarmante en las dos últimas décadas. Esto incluye el aumento dramático del número de infecciones causadas por A. baumannii multirresistentes y panrresistentes.

A. baumannii puede causar diferentes tipos de infección dependiendo de la ruta de entrada en el huésped. Las principales infecciones causadas por A. baumannii son neumonías, bacteriemias, infecciones del tracto urinario, infecciones del lecho quirúrgico y meningitis. Las infecciones respiratorias causadas por A. baumannii son las más comunes y con un mayor riesgo de muerte. En un estudio desarrollado en 2003 en Estados Unidos se describió que el 6, 9% de los casos de neumonía en pacientes ingresados en la unidad de cuidados intensivos (UCI) estaban causados por A. baumannii, lo que suponía un incremento del 72% con respecto a los casos observados en 1986 (Gaynes, R., & J. R. Edwards. 2005. Clin Infect Dis 41:848854) . Aunque la neumonía nosocomial es la forma más común de la enfermedad, algunos casos de neumonías adquiridas en la comunidad son causadas por A. baumannii. Al igual que la neumonía nosocomial, la neumonía adquirida en la comunidad causada por Acinetobacter presenta una tasa de mortalidad alta. En un e

estudio desarrollado en España se muestra que el 3, 1% de las neumonías graves adquiridas en la comunidad estaban causadas por A. baumanni (Pachon et al., 1990. Am Rev Respir Dis 142:369-373) .

El tratamiento de las infecciones causadas por A. baumannii ha sido complicado debido a la emergencia durante las últimas dos décadas de cepas multirresistentes y panresistentes. Un estudio llevado a cabo en Estados Unidos entre los años 1986 y 2003 demostró que la resistencia a los antibióticos más comúnmente usados se ha incrementado de forma alarmante durante este período, incluyendo un aumento en el porcentaje de aislamientos que mostraron resistencia a ceftazidima (entre un 24% y un 67%) , a amikacina (entre el 3% y el 20%) y a imipenem (entre el 0% y el 20%) (Gaynes, R., & J. R. Edwards. 2005. Clin Infect Dis 41:848-854) . Un estudio llevado a cabo en 2005 a nivel mundial en el que se analizó la resistencia a antibióticos de aislados de A. baumannii, mostró que el 34% de las cepas aisladas fueron resistentes a ceftazidima, el 40% a ciprofloxacino, el 30% a levofloxacino, el 26% a gentamicina y el 22% a cefepima (Rhomberg et al., 2007. Diagn Microbiol Infect Dis 59:425-432) . Debido a este notable incremento de las infecciones causadas por A. baumannii, y la emergencia de cepas altamente resistentes, se requiere en la actualidad el desarrollo de nuevas estrategias para controlar estas infecciones, entre ellas una detección precoz de la bacteria.

Los métodos actuales para determinar el agente causante de infecciones bacterianas requieren el cultivo de muestras clínicas y test bioquímicos, un proceso que puede tardar entre 48 y 72 horas para llegar a una identificación definitiva de la bacteria. Dados los problemas inherentes que presentan los sistemas de identificación fenotípicos (no todas las cepas de una misma especie muestran características homogéneas, una misma cepa puede generar diferentes patrones en ensayos repetidos y también las limitaciones en las bases de datos, entre otros) , los métodos moleculares se han erigido como procedimientos complementarios, alternativos o incluso de referencia a los fenotípicos. En la década de los 80, comenzó la búsqueda de candidatos que, siendo genes estables, permitieran establecer relaciones filogenéticas entre las bacterias, como los genes que codifican para las subunidades ribosómicas 5S, 16S, 23S y sus espacios intergénicos.

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Sin embargo, no todas las regiones empleadas de forma general resultan útiles en la identificación de todos los géneros y especies bacterianos. Así, aunque en muchos casos se considera que la secuenciación de la fracción 23S puede ser una buena alternativa en los casos en los que la fracción 16s no proporciona resultados concluyentes, presenta una serie de inconvenientes que han sido evaluados por algunos autores, como dificultades para la amplificación de fragmentos más grandes de forma rutinaria con propósitos taxonómicos o la existencia de abundantes secuencias de inserción (IS) . Otras regiones, como la subunidad ß de la ARN polimerasa, presentan el inconveniente de que no se pueden utilizar cebadores universales para su amplificación. Y en algunos casos, las regiones empleadas no son adecuadas, debido a que están sometidas a transferencia horizontal genética, y dan lugar a identificaciones erróneas.

Es necesario, por tanto, encontrar una región adecuada para la identificación clínica de bacterias del orden Pseudomonadales, más concretamente de la familia Moraxellaceae, y aún más concretamente del género Acinetobacter, así como un método específico, eficiente y validado, de alta repetitividad y reproducibilidad, que permita la detección de distintas cepas del patógeno Acinetobacter baumannii en muestras clínicas que presentan una baja contaminación, pudiendo incluso detectar ADN libre, presente en el ambiente.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han identificado la región del gen que codifica para la proteína de membrana externa A (gen ompA) , como una región útil para la detección clínica de bacterias gram negativas, concretamente especies del orden Pseudomonadales, y en especial del género Acinetobacter.

Tal y como se entiende en la presente invención, la región útil (gen ompA) para la detección clínica de especies del orden Pseudomonadales, y en especial del género Acinetobacter, se define por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que e

constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 2, y

que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a) ,

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ompA.

En una realización particular de la invención, la región útil para la detección clínica de especies del orden Pseudomonadales, y en especial del género Acinetobacter, se define por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) las moléculas de ácido nucleico que se encuentra entre las posiciones 3001200 de la SEQ ID No 1, más preferiblemente la región 550-1000 de la SEQ ID No 1, y aún más preferiblemente, la región 774-859 de la SEQ ID No 1

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a) ,

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la secuencia polinucleotídica de a) , y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ompA.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de la secuencia nucleotídica localizada en el gen ompA o una región de la misma, para la identificación de bacterias gram negativas, concretamente las pertenecientes al... [Seguir leyendo]

1. Método para la detección de Acinetobacter Baumannii mediante la identificación de la presencia o ausencia de una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las siguientes variantes:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a) ,

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ompA.;

en una muestra biológica.

2. Método para la detección de Acinetobacter Baumannii mediante la identificación de la presencia o ausencia de una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las siguientes variantes:

a) molécula de ácido nucleico que se encuentra entre las posicione.

30. 1200 de la SEQ ID No 1 o en la regió.

55. 1000 de la SEQ ID No 1 o en la región 774859 de la SEQ ID No 1

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a) ,

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la secuencia polinucleotídica de a) y/o b) y/o c) , y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ompA.;

e en una muestra biológica.

3. Secuencia nucleotídica que consiste en la SEQ ID NO: 3, o cualquiera de sus variantes.

4. Secuencia nucleotídica que consiste en la SEQ ID NO: 4, o cualquiera de sus variantes.

5. Secuencia nucleotídica que consiste en la SEQ ID NO: 5, o cualquiera de sus variantes.

6. Set de cebadores/sonda, donde la secuencia de los cebadores son las secuencias según las reivindicaciones 3 y 4, y la secuencia de la sonda es la secuencia según se describe en la reivindicación 5.

7. Método para la detección específica de A. baumannii, o de la presencia de ADN genómico de A. baumannii en una muestra biológica, que comprende emplear al menos las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

8. Método para la detección específica de A. baumannii, o de la presencia de ADN genómico de A. baumannii en una muestra biológica según la reivindicación anterior, que además comprende emplear la secuencia según se describe en la reivindicación 5.

9. Método para la detección específica de A. baumannii, o de la presencia de ADN genómico de A. baumannii en una muestra biológica, que comprende:

a) obtener una muestra biológica donde se quiere testar si existe Acinetobacter baumannii,

b) preparar una mezcla de reacción que comprenda el set de cebadores/sonda según se describe en la reivindicación 6, y la muestra biológica a testar de (a) ,

e c) someter la mezcla de reacción de (b) a condiciones de amplificación, para generar al menos una copia de una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia diana, d) hibridar la sonda a la secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia diana, de manera que se forme un híbrido que comprenda la sonda y la secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia diana.

10. Método para la monitorización de la respuesta a un tratamiento de infección por

A. baumannii in vitro, que comprende los pasos (a) – (d) según la reivindicación anterior, y además comprende realizar tomas de muestras seriales de pacientes que están recibido un tratamiento.

11. Kit que comprende el par de cebadores de secuencias SEQ ID No 3 y SEQ No 4, para amplificar, de forma simultánea y en una sola reacción, mediante la técnica de la PCR, un fragmento de la región o gen ompA de una bacteria de la especie A. baumannii.

12. Kit según la reinvidicación anterior, que además comprende la sonda marcada de SEQ ID No 5.

13. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, para la detección de bacterias de la especie A. baumannii.

14. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, para la monitorización de la respuesta a un tratamiento de una enfermedad causada por bacterias de la especie A. baumannii.

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FIG. 1

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FIG. 2