Método de definición del grado de diferenciación de un tumor.

Un método in vitro de definir el grado de diferenciación de un tumor con genes y/o proteínas seleccionadosmediante análisis estadísticos basados en el nivel o patrón de expresión de los genes y/o las proteínas detejidos tumorales humanos obtenibles de pacientes de cáncer,

en donde los genes y/o proteínas seseleccionan en orden descendiente del cociente de Fisher y en donde el cociente de Fisher se determina sinel uso de una probabilidad previa, en donde el cociente de Fisher para un gen j está dado por **Fórmula**

donde es la media de la muestra del nivel de expresión del gen j para las muestras en grado i, y esla varianza de la muestra del nivel de expresión del gen j para las muestra en grado i

Método de definición del grado de diferenciación de un tumor

Campo técnico La presente invención se refiere a un método de definición del grado de diferenciación de un tumor. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método de definición del grado de diferenciación de un tumor mediante la selección de genes y/o proteínas cuyo nivel de expresión se correlaciona con cada grado de diferenciación del carcinoma hepatocelular (CHC) , midiendo de la expresión de los genes y/o proteínas de los tejidos tumorales humanos en cada grado de diferenciación.

También se divulga el uso de estos genes y/o proteínas para diagnosticar el grado de diferenciación del CHC y para el cribado de agentes anticancerosos para el tratamiento del CHC.

También se divulga un kit para realizar el método de la presente invención que comprende chips de ADN, chips de oligonucleótidos, chips de proteínas, péptidos, anticuerpos, sondas y cebadores que son necesarios para micromatrices de ADN, micromatrices de oligonucleótidos, matrices de proteínas, transferencia northern, hibridación in situ, ensayos de protección de RNasas, inmunotransferencia, ensayos ELISA, transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa (de aquí en adelante denominado RT-PCR) para examinar la expresión de los genes y/o proteínas cuyo nivel de expresión se correlaciona con el grado de diferenciación del tumor.

Antecedentes técnicos El cáncer es la principal causa de muerte en el mundo. Particularmente, el carcinoma hepatocelular (CHC) es uno de los cánceres más comunes en el mundo, que representa un problema internacional principal de salud debido a su incidencia creciente en muchos países (Schafer, D.E. y Sorrell, M.F. Hepatocellular carcinoma, Lancet 353, 12531257 (1999) , Colombo, M. Hepatitis C virus and hepatocellular carcinoma, Semin. Liver Dis. 19, 263-269 (1999) , y Okuda, K. Hepatocellular carcinoma, J. Hepatol. 32, 225-237 (2000) ) . La infección crónica por el virus de la hepatitis C (HCV) es uno de los principales factores de riesgo para el CHC así como la infección por el virus de la hepatitis B (HBV) , consumo de alcohol y varios carcinógenos tal como aflatoxina B1 (Okuda, K. Hepatocellular carcinoma, J. Hepatol. 32, 225-237 (2000) ) . Se han adoptado varias terapias para el tratamiento del CHC. Esas incluyen resección quirúrgica, radioterapia, quimioterapia y terapia biológica incluyendo terapia hormonal y génica. Sin embargo, ninguna de estas terapias pudo curar la enfermedad. Uno de los principales problemas del tratamiento del CHC es que las características de las células cancerosas cambian durante el desarrollo y evolución de la enfermedad. Particularmente, los cambios en el grado de diferenciación de las células tumorales son aparentes y frecuentes. Tales cambios alteran la capacidad de las células tumorales de invadir y metastatizar y también la sensibilidad de las células cancerosas a las diferentes terapias, produciendo resistencia a agentes anticancerosos. Si los cambios en las características de las células cancerosas se diagnostican y tratan de forma precisa, la terapia contra el cáncer será más eficaz.

Estudios previos sugirieron la implicación de genes supresores de tumores y oncogenes tales como los genes p53, f-catenina y AXIN1 en la hepatocarcinogénesis (Okabe, H., Satoh, S., Kato, T., Kitahara, O., Yanagawa, R., Yamaoka, Y., Tsunoda, T., Furukawa, Y., y Nakamura, Y. Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cDNA microarray: identification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression, Cancer Res. 61, 2129-2137 (2001) ) . También se ha sugerido que el desarrollo de CHC asociado al HCV se puede caracterizar por la evolución patológica desde el tumor temprano al avanzado, que se correlaciona con la desdiferenciación de las células cancerosas (Kojiro, M. Pathological evolution of early hepatocellular carcinoma, Oncology 62, 43-47 (2002) ) . Particularmente después de la introducción de las tecnologías de micromatrices de ADN en las ciencias médicas (Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W., y Brown, P.O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementar y DNA microarray, Science 270, 467-470 (1995) , DeRisi, J., Penland, L., Brown, P.O., Bittner, M.L., Meltzer, P.S., Ray, M., Chen, Y., Su, Y.A., y Trent, J.M. Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer, Nat. Genet. 14, 457-460 (1996) ) , muchos estudios mostraron patrones de expresión génica relacionados con algunos aspectos del CHC (Lau, W.Y., Lai, P.B., Leung, M.F., Leung, B.C., Wong, N., Chen, G., Leung, T.W., y Liew, C.T. Differential gene expression of hepatocellular carcinoma using cDNA microarray analysis, Oncol. Res. 12, 59-69 (2000) , Tackels-Horne, D., Goodman, M.D., Williams, A.J., Wilson, D.J., Eskandari, T., Vogt, L.M., Boland, J.F., Scherf, U., y Vockley, J.G. Identification of differentially expressed genes in hepatocellular carcinoma and metastatic liver tumors by oligonucleotide expression profiling, Cancer 92, 395-405 (2001) , Xu, L., Hui, L., Wang, S., Gong, J., Jin, Y., Wang, Y., Ji, Y., Wu, X., Han, Z., y Hu, G. Expression profiling suggested a regulator y role of liver-enriched transcription factors in human hepatocellular carcinoma, Cancer Res. 61, 3176-3681 (2001) , Xu, X.R., Huang, J., Xu, Z.G., Qian, B.Z. Zhu, Z.D., Yan, Q., Cai, T., Zhang, X., Xiao, H.S., Qu, J., Liu, F., Huang, Q.H., Cheng, Z.H. , Li, N.G., Du, J.J. , Hu, W., Shen, K.T., Lu, G., Fu, G., Zhong, M., Xu, S.H., Gu, W.Y., Huang, W., Zhao, X.T., Hu, G.X., Gu, J.R., Chen, Z., y Han, Z.G. Insight into hepatocellular carcinogenesis at transcriptome level by comparing gene expression profiles of hepatocellular carcinoma with those of corresponding non-cancerous liver, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15089-15094 (2001) , Okabe, H., Satoh, S., Kato, T., Kitahara, O., Yanagawa, R., Yamaoka, Y., Tsunoda, T., Furukawa, Y., y Nakamura,

Y. Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cDNA microarray: identification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression, Cancer Res. 61, 2129-2137 (2001) , Shirota, Y., Kaneko, S., Honda, M., Kawai, H.F., y Kobayashi, K. Identification of differentially expressed genes in hepatocellular carcinoma with cDNA microarrays, Hepatology 33, 832-840 (2001) , Delpuech, O., Trabut, J.B., Carnot, 5 F., Feuillard, J., Brechot, C., y Kremsdorf, D. Identification, using cDNA macroarray analysis, of distinct gene expression profiles associated with pathological and virological features of hepatocellular carcinoma, Oncogene 21, 2926-2937 (2002) , Iizuka, N., Oka, M., Yamada-Okabe, H., Mori, N., Tamesa, T., Okada, T., Takemoto, T., Tangoku, A., Hamada, K., Nakayama, H., Miyamoto, T., Uchimura, S., y Hamamoto, Y. Comparison of gene expression profiles between hepatitis B virus- and hepatitis C virus-infected hepatocellular carcinoma by oligonucleotide microarray data based on a supervised learning method, Cancer Res. 62, 3939-3944 (2002) , y Midorikawa, Y., Tsutsumi, S., Taniguchi, H., Ishii, M., Kobune, Y., Kodama, T., Makuuchi, M., y Aburatani, H. Identification of genes associated with dedifferentiation of hepatocellular carcinoma with expression profiling analysis, Jpn. J. Cancer Res. 93, 636-643 (2002) ) . Entre ellos, dos estudios determinaron el perfil de expresión génica en CHC respecto a su desarrollo (Okabe, H., Satoh, S., Kato, T., Kitahara, O., Yanagawa, R., Yamaoka, Y., Tsunoda, T., Furukawa, Y., y Nakamura,

Y. Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cDNA microarray: identification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression, Cancer Res. 61, 2129-2137 (2001) y Midorikawa, Y., Tsutsumi, S., Taniguchi, H., Ishii, M., Kobune, Y., Kodama, T., Makuuchi, M., y Aburatani, H. Identification of genes associated with dedifferentiation of hepatocellular carcinoma with expression profiling analysis, Jpn. J. Cancer Res. 93, 636-643 (2002) ) . Sin embargo, no se sabe nada sobre los genes y/o las proteínas que caracterizan y/o regulan cada grado de diferenciación del CHC durante el curso de la oncogénesis y el desarrollo de CHC asociado al HCV. Se pueden usar genes y/o proteínas que regulan el grado de diferenciación del CHC para diagnosticar el grado de diferenciación del CHC y para el cribado de agentes anticancerosos para el tratamiento del CHC que surge de la infección crónica de HCV.

Previamente, se ha divulgado un sistema de puntuación para la predicción de la reaparición de cáncer que implica el cociente de Fisher (documento WO 03/010337) . Además, se ha descrito la comparación de los perfiles de expresión génica entre carcinoma hepatocelular infectado por virus de la hepatitis B y por virus de la... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro de definir el grado de diferenciación de un tumor con genes y/o proteínas seleccionados mediante análisis estadísticos basados en el nivel o patrón de expresión de los genes y/o las proteínas de tejidos tumorales humanos obtenibles de pacientes de cáncer, en donde los genes y/o proteínas se seleccionan en orden descendiente del cociente de Fisher y en donde el cociente de Fisher se determina sin la varianza de la muestra del nivel de expresión del gen j para las muestra en grado i.

2. El método in vitro según la reivindicación 1, en donde los tejidos humanos son tejidos hepáticos humanos.

3. El método in vitro según la reivindicación 2, en donde el grado de diferenciación del tumor se selecciona del grupo que consiste en hígado no canceroso, hígado precanceroso, carcinoma hepatocelular (CHC) bien diferenciado, CHC moderadamente diferenciado y CHC mal diferenciado.

4. El método in vitro según la reivindicación 3, en donde los genes y/o las proteínas se expresan diferencialmente entre hígado no canceroso e hígado precanceroso, hígado precanceroso y carcinoma hepatocelular (CHC) bien diferenciado, CHC bien diferenciado y CHC moderadamente diferenciado, o CHC moderadamente diferenciado y CHC mal diferenciado.

5. El método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el nivel o patrón de expresión de

los genes y/o proteínas se examina por medio de micromatriz de ADN, transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa o matriz de proteínas.

6. El método in vitro según la reivindicación 5, en donde el número de los genes y/o proteínas está entre 40 y

100.

7. El método in vitro según la reivindicación 5, en donde el número de los genes y/o proteínas está entre 35 y 45.

8. El método in vitro según la reivindicación 7, en donde el número de los genes y/o proteínas es 40.

9. Un método in vitro de definir el grado de diferenciación de un tumor, el método comprende los pasos de:

(a) seleccionar genes y/o proteínas que tienen los mayores cocientes de Fisher en la comparación entre hígado no canceroso e hígado precanceroso, hígado precanceroso y carcinoma hepatocelular (CHC) bien diferenciado, CHC bien diferenciado y CHC moderadamente diferenciado, o CHC moderadamente diferenciado y CHC mal diferenciado; y

(b) definir el grado de diferenciación de un tumor usando los genes y/o proteínas, en donde el cociente de

Fisher se determina sin el uso de una probabilidad previa, en donde el cociente de Fisher para un gen j está dado por

donde es la media de la muestra del nivel de expresión del gen j para las muestras en grado i, y es la varianza de la muestra del nivel de expresión del gen j para las muestra en grado i.

10. Un método in vitro de definir el grado de diferenciación de un tumor, el método comprende los pasos de:

(a) determinar el número de genes y/o proteínas para definir el grado de diferenciación de un tumor;

(b) seleccionar genes y/o proteínas que tienen los mayores cocientes de Fisher en la comparación entre hígado no canceroso e hígado precanceroso, hígado precanceroso y carcinoma hepatocelular (CHC) bien diferenciado, CHC bien diferenciado y CHC moderadamente diferenciado, o CHC moderadamente diferenciado y CHC mal diferenciado;

(c) aplicar los datos de genes y/o proteínas seleccionados en el paso (b) a todas las muestras; y

(d) definir el grado de diferenciación de un tumor, en donde el cociente de Fisher se determina sin el uso de una probabilidad previa, en donde el cociente de Fisher para un gen j está dado por

5 la varianza de la muestra del nivel de expresión del gen j para las muestra en grado i.

11. Un método in vitro de definir el grado de diferenciación de un tumor, el método comprende los pasos de:

(a) determinar el número de genes y/o proteínas para definir el grado de diferenciación de un tumor;

10 (b) seleccionar genes y/o proteínas que tienen los mayores cocientes de Fisher en la comparación entre

hígado no canceroso e hígado precanceroso, hígado precanceroso y carcinoma hepatocelular (CHC)

bien diferenciado, CHC bien diferenciado y CHC moderadamente diferenciado, o CHC

moderadamente diferenciado y CHC mal diferenciado;

(c) aplicar los datos de genes y/o proteínas seleccionados en el paso (b) a todas las muestras;

15 (d) diseñar un clasificador de distancia mínima con los datos de los genes y/o proteínas seleccionados en

el paso (b) ;

(e) aplicar el clasificador de distancia mínima diseñado en el paso (d) a todas las muestras;

(f) generar un mapa autoorganizado con los datos de todos los genes y/o proteínas seleccionados en el

paso (b) ;

20 (g) aplicar el mapa autoorganizado generado en el paso (f) a todas las muestras; y

(h) definir el grado de diferenciación de un tumor,

en donde el cociente de Fisher se determina sin el uso de una probabilidad previa, en donde el cociente de