Metilación y expresión génicas.

Un método para preparar una biblioteca de cariotipado digital específica de metilación (MSDK),

comprendiendo el método:

proporcionar la totalidad o parte del ADN genómico de una célula de ensayo eucariótica;

exponer el ADN a una enzima de restricción de mapeo sensible a la metilación (MMRE) para generar una pluralidad de primeros fragmentos;

conjugar a una terminación o a las dos terminaciones de cada uno de los primeros fragmentos un resto de unión, comprendiendo el resto de unión un primer miembro de un par de afinidad, dando lugar la conjugación a una pluralidad de segundos fragmentos;

exponer la pluralidad de segundos fragmentos a una enzima de restricción de fragmentación (FRE) para generar una pluralidad de terceros fragmentos, conteniendo cada tercer fragmentos en una terminación el primer miembro del par de afinidad y en la otra terminación la secuencia de corte en 5' del FRE o la secuencia de corte en 3' de la FRE;

poner en contacto la pluralidad de terceros fragmentos con un sustrato insoluble que tenga unida al mismo una pluralidad de segundos miembros del par de afinidad, dando lugar dicho contacto a una pluralidad de terceros fragmentos unidos, siendo cada tercer fragmento unido un tercer fragmento unido a través del primero y segundo miembros del par de afinidad al sustrato insoluble;

conjugar a las terminaciones libres de los terceros fragmentos unidos un resto de liberación, comprendiendo el resto de liberación una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de liberación (RRE) y, en 3' de la secuencia de reconocimiento de la RRE, la secuencia de corte en 5' de la FRE o la secuencia de corte en 3' de la FRE, dando lugar la conjugación a una pluralidad de cuartos fragmentos unidos, en que cada cuarto fragmento unido (i) comprende en una terminación en la secuencia de reconocimiento de la RRE y (ii) estando unido a través del primer miembro del par de afinidad de la otra terminación y el segundo miembro del par de afinidad al sustrato insoluble; y

exponer los cuartos fragmentos unidos a la RRE, dando lugar la exposición a la liberación del sustrato insoluble de una biblioteca de MSDK, comprendiendo la biblioteca una pluralidad de quintos fragmentos, comprendiendo cada quinto fragmento el resto de liberación y una etiqueta de MSDK, consistiendo la etiqueta en una pluralidad de pares 35 de bases del ADN genómico.

Metilación y expresión génicas

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/685.104, presentada el 27 de mayo de 2005.

Declaración relativa a la investigación patrocinada por el Gobierno Federal de los EE.UU.

La investigación descrita en esta solicitud fue financiada en parte por subvenciones (nº CA89393 y CA94074) del Instituto Nacional del Cáncer (“National Cancer Institute”) de los Institutos Nacionales de la Salud (“National Institutes of Health”) , y subvenciones (nº DAMD 17-02-1-0692 y W8IXWH-04-1-0452) del Ministerio de Defensa (“Department of Defense”) . De este modo, el gobierno de EE.UU. tiene ciertos derechos sobre la invención.

Campo técnico Esta invención se refiere a la regulación génica epigenética y, más particularmente a la metilación de ADN y su erecto sobre la expresión génica y su uso como un marcador de un tipo de células y/o estado de enfermedad particulares.

Antecedentes Los cambios epigenéticos (por ejemplo, cambio en los niveles de metilación de ADN) , así como los cambios genéticos, pueden ser detectados en células cancerosas y células estromales en tumores. Con el fin de desarrollar métodos de diagnóstico más discriminatorios y métodos terapéuticos más eficaces, es importante que estos efectos epigenéticos puedan ser definidos y caracterizados. DAI ET AL.: "An Ascl Boundar y librar y for the studies of genetic and epigenetic alterations in CpG Islands", GENOME RESEARCH, vol. 12, 2002, páginas 1591-1598, describe un método para preparar una biblioteca genómica específica de metilación.

Sumario Los inventores han desarrollado un método para valorar el nivel de metilación en la totalidad o una parte de un genoma. A este método lo denominan “Methilation Specific Digital Kar y otyping” (MSDK) . El método MSDK puede ser

adaptado para establecer un perfil de metilación genómico del ensayo para una célula de ensayo de interés. Al comparar el perfil del ensayo con los perfiles testigos obtenidos con tipos de células definidos, puede ser identificada la célula del ensayo. El método MSDK puede ser usado también para identificar genes en una célula de ensayo (por ejemplo, una célula cancerosa) cuya metilación está alterada (aumentada o disminuida) con relación a una célula testigo correspondiente) , por ejemplo, una normal del mismo tejido como la célula cancerosa) . Esta información proporciona la base para métodos para discriminar si una célula de ensayo de interés (a) es la misa que una célula testigo (por ejemplo, una célula normal) o (b) es diferente de una célula testigo pero es, por ejemplo, una célula patológica como una célula cancerosa. Estos métodos incluyen, por ejemplo, valorar el nivel de metilación de ADN o el nivel de expresión de genes de interés, o el nivel de metilación de ADN en un área coromosomal particular en células de ensayo y comprar los resultados con los obtenidos con células testigos.

Más específicamente, la invención aborda un método para preparar una biblioteca de cariotipado digital específico de metilación (MSDK) . El método incluye:

proporcionar la totalidad o parte del ADN genómico de una célula de ensayo eucariótica;

exponer el ADN a una enzima de restricción de mapeo sensible a la metilación (MMRE) para generar una pluralidad de primeros fragmentos;

conjugar a una terminación o a las dos terminaciones de cada uno de los primeros fragmentos un resto de unión, comprendiendo el resto de unión un primer miembro de un par de afinidad, dando lugar la conjugación a una pluralidad de segundos fragmentos;

exponer la pluralidad de segundos fragmentos a una enzima de restricción de fragmentación (FRE) para generar una pluralidad de terceros fragmentos, conteniendo cada tercer fragmentos en una terminación el primer miembro del par de afinidad y en la otra terminación la secuencia de corte en 5’ del FRE o la secuencia de corte en 3’ de la FRE;

poner en contacto la pluralidad de terceros fragmentos con un sustrato insoluble que tenga unida al mismo una pluralidad de segundos miembros del par de afinidad, dando lugar dicho contacto a una pluralidad de terceros fragmentos unidos, siendo cada tercer fragmento unido un tercer fragmentos unido a través del primero y segundo miembros del par de afinidad al sustrato insoluble;

conjugar a las terminaciones libres de los terceros fragmentos unidos un resto de liberación, comprendiendo el resto de liberación una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de liberación (RRE) y, en 3’ de la secuencia de reconocimiento de la RRE, la secuencia de corte en 5’ de la FRE o la secuencia de corte en 3’ de la FRE, dando lugar la conjugación a una pluralidad de cuartos fragmentos unidos, en que cada cuarto fragmento unido (i) comprende en una terminación en 5 la secuencia de reconocimiento de la RRE y (ii) estando unido a través del primer miembro del par de afinidad de la otra terminación y el segundo miembro del par de afinidad al sustrato insoluble; y

exponer los cuartos fragmentos unidos a la RRE, dando lugar la exposición a la liberación del sustrato insoluble de una biblioteca de MSDK, comprendiendo la biblioteca una pluralidad de quintos fragmentos, comprendiendo cada quinto fragmento el resto de liberación y una etiqueta de MSDK, consistiendo la etiqueta en una pluralidad de pares de bases del ADN genómico. Por tanto, el método da lugar a la producción de una pluralidad de etiquetas de MSDK.

En el método, la MMRE puede ser, por ejemplo, Ascl, la FRE puede ser, por ejemplo, Nlalll y la RRE puede ser, por ejemplo, Mmel. El resto de unión puede incluir adicionalmente una secuencia de corte en 5’ o 3’ de la MMRE. El resto de unión puede incluir también adicionalmente, entre la secuencia de reconocimiento en 5’ o 3’ de la MMRE y

el primer miembro de un par de afinidad, una secuencia de ácido nucleico conectora que comprende una pluralidad

de pares de bases. El resto de liberación puede incluir adicionalmente, en 5’ de la secuencia de reconocimiento de RRE, una secuencia de ácido nucleico extensora que comprende una pluralidad de pares de bases. La célula del ensayo puede ser una célula de vertebrado y la célula de ensayo de vertebrado puede ser una célula de ensayo de mamífero, por ejemplo, una célula de ensayo humana. Además, la célula de ensayo puede ser una célula normal o, por ejemplo, una célula cancerosa, por ejemplo, una célula de cáncer de mamas. El primer miembro del par de afinidad puede ser biotina, iminobiotina, avidina o un fragmento funcional de avidina, un antígeno, un determinante hapténico, una secuencia de nucleótidos de cadena única, una hormona, un ligando para receptor de adhesión, un receptor para un ligando de adhesión, un ligando para una lectina, una lectina, una molécula que contiene la totalidad o una parte de una región Fc de inmunoglobulina, proteína A bacteriana o proteína Ge bacteriana. El sustrato insoluble puede incluir o puede ser, gránulos magnéticos.

También se proporciona mediante la invención un método para analizar una biblioteca MSDK. El método incluye: proporcionar una biblioteca MSDK preparada mediante el método anteriormente descrito e identificar las secuencias de nucleótidos de una etiqueta, una pluralidad de etiquetas o la totalidad de las etiquetas. La identificación de las secuencias de nucleótidos de una pluralidad de etiquetas puede incluir: preparar una pluralidad de dietiquetas, conteniendo cada dietiqueta dos quintos fragmentos conjuntamente ligados; formar un concatámero que contiene una pluralidad de dietiquetas o fragmentos de dietiquetas, en que cada fragmento de dietiqueta contiene dos etiquetas de MSDK; determinar la secuencia de nucleótidos del concatámero y deducir, a partir de la secuencia de nucleótidos del concatámero, las secuencias de nucleótidos de una o más de las etiquetas de MSDK que contiene el concatámero. Los fragmentos de dietiquetas pueden ser preparados exponiendo las dietiquetas a la FRE. El método puede incluir adicionalmente, después de preparar una pluralidad de dietiquetas y antes de formar los concatámeros, que el número (abundancia) de dietiquetas individuales es aumentado mediante PCR. El método puede incluir adicionalmente determinar la frecuencia relativa de algo o la totalidad de las etiquetas.

Otro aspecto de la invención es un método adicional de analizar una biblioteca de MSDK. El método incluye: proporcionar una biblioteca de MSDK preparada mediante el método anteriormente descrito; identificar un sitio cromosomal correspondiente... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar una biblioteca de cariotipado digital específica de metilación (MSDK) , comprendiendo el método:

proporcionar la totalidad o parte del ADN genómico de una célula de ensayo eucariótica;

exponer el ADN a una enzima de restricción de mapeo sensible a la metilación (MMRE) para generar una pluralidad de primeros fragmentos;

conjugar a una terminación o a las dos terminaciones de cada uno de los primeros fragmentos un resto de unión, comprendiendo el resto de unión un primer miembro de un par de afinidad, dando lugar la conjugación a una pluralidad de segundos fragmentos;

exponer la pluralidad de segundos fragmentos a una enzima de restricción de fragmentación (FRE) para generar una pluralidad de terceros fragmentos, conteniendo cada tercer fragmentos en una terminación el primer miembro del par de afinidad y en la otra terminación la secuencia de corte en 5’ del FRE o la secuencia de corte en 3’ de la FRE;

poner en contacto la pluralidad de terceros fragmentos con un sustrato insoluble que tenga unida al mismo una pluralidad de segundos miembros del par de afinidad, dando lugar dicho contacto a una pluralidad de terceros fragmentos unidos, siendo cada tercer fragmento unido un tercer fragmento unido a través del primero y segundo miembros del par de afinidad al sustrato insoluble;

conjugar a las terminaciones libres de los terceros fragmentos unidos un resto de liberación, comprendiendo el resto de liberación una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de liberación (RRE) y, en 3’ de la secuencia de reconocimiento de la RRE, la secuencia de corte en 5’ de la FRE o la secuencia de corte en 3’ de la FRE, dando lugar la conjugación a una pluralidad de cuartos fragmentos unidos, en que cada cuarto fragmento unido (i) comprende en una terminación en 5 la secuencia de reconocimiento de la RRE y (ii) estando unido a través del primer miembro del par de afinidad de la otra terminación y el segundo miembro del par de afinidad al sustrato insoluble; y

exponer los cuartos fragmentos unidos a la RRE, dando lugar la exposición a la liberación del sustrato insoluble de una biblioteca de MSDK, comprendiendo la biblioteca una pluralidad de quintos fragmentos, comprendiendo cada quinto fragmento el resto de liberación y una etiqueta de MSDK, consistiendo la etiqueta en una pluralidad de pares de bases del ADN genómico.

2. El método de la reivindicación 1, en el que se aplican uno o más de lo siguiente:

(i) la MMRE es Ascl;

(ii) la FRE es NlaIII;

(iii) la RRE es MmeI;

(iv) el resto de unión comprende adicionalmente una secuencia de corte en 5’ ó 3’ de la MMRE;

(v) el resto de unión comprende adicionalmente, entre la secuencia de reconocimiento en 5’ ó 3’ de la MMRE y el primer miembro de un par de afinidad, una secuencia conectora de ácidos nucleicos que comprende una pluralidad de pares de bases;

(vi) el resto de liberación comprende adicionalmente en 5’ de la secuencia de reconocimiento de RRE una secuencia de ácidos nucleicos extensora que comprende una pluralidad de pares de bases;

(vii) la célula de ensayo es una célula de vertebrado (por ejemplo, una célula de ensayo de mamífero o ser humano) ;

(viii) la célula de ensayo es una célula normal;

(ix) la célula de ensayo es una célula cancerígena (por ejemplo, una célula de cáncer de mamas) ;

(x) el primer miembro del par de afinidad es biotina o iminobiotina;

(xi) el primer miembro del par de afinidad es un antígeno, un determinante hapténico, una secuencia de nucleótidos de cadena única, una hormona, un ligando para receptor de adhesión, un receptor para ligando de adhesión, un ligando para una lectina, una lectina, una molécula que contiene la totalidad o parte de una región Fc de inmunoglobulina, proteína A bacteriana o proteína G bacteriana;

(xii) el sustrato insoluble comprende esferitas magnéticas.

3. Un método para analizar una biblioteca de MSDK, comprendiendo el método:

proporcionar una biblioteca de MSDK preparada mediante el método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2; y

identificar las secuencias de nucleótidos de una etiqueta, una pluralidad de etiquetas o la totalidad de las etiquetas, incluyendo opcionalmente dicho método la etapa de determinar la frecuencia relativa de algunas o la totalidad de las etiquetas, si están presente más de una etiqueta.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la identificación de las secuencias de nucleótidos de una pluralidad de etiquetas comprende:

preparar una pluralidad de dietiquetas, comprendiendo cada dietiqueta dos fragmentos quintos fragmentos conjuntamente ligados;

formar un concatámero que comprende una pluralidad de dietiquetas o fragmentos de dietiquetas, en que cada fragmento de dietiquetas comprende dos etiquetas de MSDK;

determinar la secuencia de nucleótidos del concatámero; y

deducir, a partir de la secuencia de nucleótidos del concetámero, las secuencias de nucleótidos de una o más de las etiquetas de MSDK que comprende el concatámero.

5. El método de la reivindicación 4, que tiene una o más de las siguientes características: i) preparar los fragmentos de dietiquetas exponiendo las dietiquetas a la FRE; ii) después de preparar una pluralidad de dietiquetas y antes de formar los concatámeros, aumentar el número de

dietiquetas mediante PCR; iii) determinar una ubicación cromosomal, en el genoma de la célula de ensayo, de una secuencia de reconocimiento completa no metilada de la MMRE más próxima al sitio cromosomal identificado.

6. Un método para analizar una biblioteca de MSDK, comprendiendo el método: proporcionar una biblioteca de MSDK preparada mediante un método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2; y identificar un sitio cromosomal correspondiente a la secuencia de una etiqueta seleccionada a partir de la biblioteca.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la identificación del sitio cromosomal y la determinación de la ubicación cromosomal se realiza mediante un procedimiento que comprende comparar la secuencia de nucleótidos de la etiqueta seleccionada con una biblioteca de etiquetas virtuales generada usando la secuencia de nucleótidos del genoma o la parte de un genoma, la secuencia de nucleótidos de la secuencia de reconocimiento completa de la MMRE, la secuencia de nucleótidos de la secuencia de reconocimiento completa de la FRE y el número de nucleótidos que separa la secuencia de reconocimiento completa de la RRE del sitio de corte de la RRE.

8. Un método para determinar la ubicación cromosomal de una pluralidad de secuencias de reconocimiento no metiladas de la MMRE, comprendiendo el método la repetición del método de la reivindicación 5, etapa iii) , con una pluralidad de etiquetas obtenidas a partir de la biblioteca.

9. Un método para clasificar una célula biológica, comprendiendo el método:

a) realizar el método de la reivindicación 3, incluida dicha etapa opcional, obteniendo así un perfil de MSDK de ensayo para la célula de ensayo; b) comparar el perfil de MSDK de ensayo para separar los perfiles de expresión de MSDK testigos para uno o más tipos de células testigos; c) seleccionar un perfil de MSDK testigo que se asemeja más estrechamente al perfil de MSDK de ensayo; y d) asignar a la célula de ensayo un tipo de célula que coincida con el tipo de célula del perfil de MSDK testigo seleccionado en la etapa c) .

10. El método de la reivindicación 9, que comprende una o más de las siguientes características: i) las células de ensayo y testigos son células de vertebrados (por ejemplo, células de mamíferos o seres humanos) ;

ii) los tipos de células testigos comprenden una célula normal testigo y una célula cancerígena testigo del mismo tipo que la célula normal (por ejemplo, en que la célula normal testigo y la célula cancerígena testigo son células de mamas, o en que la célula normal testigo y la célula cancerígena testigo son de un tejido seleccionado entre el grupo que consiste en colon, pulmón, próstata y páncreas) ;

iii) la célula de ensayo es una célula de mamas, o es un tejido seleccionado entre el grupo que consiste en colon, 10 pulmón, próstata y páncreas;

iv) los tipos de células testigos comprenden células de diferentes categorías de un cáncer de un tejido único (por ejemplo, en que las diferentes categorías de un cáncer de un tejido único comprenden una célula de carcinoma de mamas ductal in situ (DCIS) y una célula de cáncer de mamas invasivo; o en que las diferentes categorías de un cáncer de un tejido único comprenden dos o más de: una célula de DCIS de grado alto, una célula de DCIS de grado intermedio y una célula de DCIS de grado bajo) ;

v) los tipos de células testigos comprenden dos o más de: una célula de cáncer de pulmón; una célula de cáncer de mamas; una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer de próstata y una célula de cáncer pancreático;

vi) los tipos de células testigos comprenden una célula epitelial obtenida a partir de tejido no canceroso y una célula mioepitelial obtenida a partir de tejido no canceroso.