Enriquecimiento de una PCR por COLD completa con secuencia de bloqueo de referencia.

Un método para enriquecer una secuencia de ácido nucleico diana en una mezcla de reacción de amplificación,

comprendiendo dicho método:

a. proporcionar un par de cebadores capaz de reasociarse a una secuencia de referencia y también a una o más secuencias diana que son al menos 50% homólogas a dicha secuencia de referencia;

b. preparar una mezcla de reacción de amplificación que incluye al menos los siguientes constituyentes:

una muestra de ácido nucleico que tiene la secuencia de referencia y de la que se sospecha que tiene la una o más secuencias diana que son al menos 50% homólogas a dicha secuencia de referencia y que también son amplificables por el par de cebadores, y

una cantidad en exceso de la secuencia de bloqueo de referencia con relación a la cantidad de secuencias de referencia, siendo la secuencia de bloqueo de referencia totalmente complementaria con al menos una parte de la secuencia de una de las cadenas de la secuencia de referencia entre sus sitios de cebador;

c. aumentar la temperatura de la mezcla de reacción de la que se sospecha que tiene dicha secuencia diana hasta una primera temperatura de desnaturalización que está por encima de la temperatura de fusión (Tm) de la secuencia de referencia y por encima de la temperatura de fusión (Tm) de la secuencia diana, con el fin de formar las cadenas de referencia desnaturalizadas y las cadenas diana desnaturalizadas;

d. reducir la temperatura de la mezcla de reacción con el fin de permitir la formación de dúplex de la secuencia de bloqueo de referencia y la cadena de referencia complementaria y heterodúplex de la secuencia de bloqueo de referencia y las cadenas dianas;

e. aumentar la temperatura de dicha mezcla de reacción hasta una temperatura crítica (Tc) suficiente para permitir la desnaturalización preferente de dichos heterodúplex de la secuencia de bloqueo de referencia y cadenas dianas en preferencia a la desnaturalización de los dúplex de la secuencia de bloqueo de referencia y las cadenas de referencia;

f. reducir la temperatura de la mezcla de reacción con el fin de permitir que dicho par de cebadores se reasocie a las cadenas dianas de cadena sencilla y a cualquier cadena de referencia de cadena sencilla en la mezcla de reacción; y

g. extender dicho par de cebadores con el fin de enriquecer dicha secuencia diana con relación a dicha secuencia de referencia;

h. repetir las etapas c hasta g durante dos o más ciclos con el fin de enriquecer dicha secuencia diana con relación a dicha secuencia de referencia.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2011/027473.

Solicitante: DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 450 Brookline Avenue Boston, MA 02215-5450 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MAKRIGIORGOS,GERASSIMOS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2665500_T3.pdf

 

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