Metilación de vectores plasmídicos.

Uso de un plásmido que comprende un gen de interés para la fabricación de un medicamento para eltratamiento de un mamífero mediante terapia génica,

en el que el uso comprende la modificación del plásmidomediante la eliminación de un dinucleótido CpG o su mutación a un dinucleótido no-CpG de al menos undinucleótido CpG dentro de dicho plásmido, y en el que el tratamiento comprende la administración del plásmido encombinación con un anfífilo catiónico.

Metilación de vectores plasmídicos

Campo técnico [0001] La presente invención se refiere a un novedoso procedimiento de reducción de la toxicidad y aumento de la eficacia de la administración génica. La presente invención también se refiere a procedimientos de modulación de la respuesta inmunoestimuladora frente al tratamiento génico, en especial, la reducción de las respuestas inmunoestimuladoras como las respuestas inflamatorias, y la reducción del estrés en el hígado.

La introducción eficaz de genes extraños y de otras moléculas biológicamente activas en células diana de mamífero es un reto al que se siguen enfrentando los expertos. La terapia génica requiere la transfección eficaz de las células diana de un paciente. La transfección, que es especialmente útil de por sí, puede definirse en términos generales como un proceso de introducción de un polinucleótido que se puede expresar (por ejemplo, un gen, un ADNc o un ARNm) para la expresión sentido o complementaria dentro de una célula. La expresión eficaz del polinucleótido codificador transfectado de esta forma da lugar a la producción en las células de un producto de transcripción y/o traducción que también es especialmente útil de por sí. Un objetivo es, por supuesto, obtener suficiente expresión para dar lugar a la corrección del estado patológico asociado al gen anómalo.

Antecedentes de la técnica [0003] Entre los ejemplos de enfermedades que son objeto de la terapia génica se incluyen: trastornos hereditarios, como fibrosis quística, hemofilia, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabr y y distrofia muscular. Ejemplos de trastornos adquiridos objetivo son: 1) para cánceres: mieloma múltiple, leucemias, melanomas, carcinoma de ovario y cáncer de pulmón microcítico; 2) para enfermedades cardiovasculares: insuficiencia cardiaca progresiva, reestenosis y hemofilias y 3) para enfermedades neurológicas: lesión cerebral traumática.

La fibrosis quística, un trastorno genético mortal común, es un ejemplo concreto de enfermedad que es diana de la terapia génica. La enfermedad está causada por la presencia de una o más mutaciones en el gen que codifica una proteína conocida como regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística («CFTR») . La fibrosis quística (FQ) se caracteriza por la producción crónica de esputo, infecciones recurrentes y destrucción del pulmón (Boat, T.F., McGraw-Hill, Inc., 1989, p. 2649 – 2680) . Aunque no se conoce con precisión cómo puede la mutación del gen CFTR causar la manifestación clínica (Welsh, M.J. y col. Cell 73: 1251 – 1254, 1993) , está bien documentada la secreción defectuosa de Cl– y el aumento de la absorción de Na + (Welsh, M.J. y col., Cell 73: 1251 – 1254, 1993; Quinton, P.M., FASEB Lett. 4: 2709 – 2717, 1990) . Además, estos cambios en el transporte iónico producen alteraciones en el transporte de fluidos a través de la superficie de epitelios glandulares (Jiang, C. y col., Science 262: 424 – 427, 1993; Jiang, C. y col., J. Physiol. (Londres) , 501.3: 637 – 647, 1997; Smith, J.J. y col. J. Clin. Invest., 91: 1148 – 1153, 1993 y Zhang, Y. y col., Am.J.Physiol 270: C1326 – 1335, 1996) . Las alteraciones resultantes en el contenido de agua y sales del líquido de las vías respiratorias (LVR) puede disminuir la actividad de péptidos bactericidas secretados por las células epiteliales (Smith, J.J. y col., Cell, 85: 229 – 236, 1996) y/o alteración del aclaramiento mucociliar, favoreciendo así las infecciones e inflamaciones pulmonares recurrentes.

Generalmente se espera que la terapia génica proporcionará una forma duradera y predecible de terapia para determinados estados patológicos, como la FQ; sin embargo, continúa existiendo la necesidad de desarrollar procedimientos mejorados que faciliten la entrada de genes funcionales en las células y cuya actividad a este respecto sea suficiente para proporcionar la administración in vivo de genes u otras moléculas biológicamente activas.

La introducción eficaz de muchos tipos de moléculas biológicamente activas ha sido difícil y no todos los procedimientos que se han desarrollado son capaces de llevar a cabo una administración eficaz de cantidades adecuadas de las moléculas deseadas en las células diana. La compleja estructura, comportamiento y entorno que presenta un tejido intacto diana de la administración intracelular de moléculas biológicamente activas, a menudo interfiere considerablemente con dicha administración. Se han empleado varios procedimientos y vehículos de administración, entre los que se incluyen vectores virales, ADN encapsulado en liposomas, vehículos lipídicos de administración y ADN desnudo, para realizar la administración de ADN dentro de las células de mamíferos. Hasta la fecha, se ha demostrado la administración de ADN in vitro, ex vivo e in vivo usando muchos de los procedimientos mencionados anteriormente.

Por ejemplo, se ha demostrado que la transfección viral es relativamente eficaz. No obstante, la respuesta inmunológica del huésped presenta posibles problemas. Específicamente, las proteínas virales activan los linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) que destruyen las células infectadas con virus acabando, así, con la expresión génica en los pulmones de modelos in vivo examinados. Otro problema es la reducida transferencia génica tras la administración repetida de vectores virales debido al desarrollo de anticuerpos antivirales neutralizantes. Actualmente estos temas se están abordando mediante la modificación tanto de los vectores como del sistema inmunitario del huésped. Asimismo, se está prestando más atención a los vectores no virales y no proteináceos como técnicas alternativas.

Puesto que los compuestos diseñados para facilitar la administración intracelular de moléculas biológicamente activas deben interaccionar tanto con entornos polares como no polares (por ejemplo, en o sobre la membrana plasmática, fluidos tisulares, compartimentos dentro de la célula y la propia molécula biológicamente activa) , dichos compuestos se diseñan habitualmente para que tengan dominios polares y no polares. Los compuestos que tienen estos dos dominios pueden denominarse anfifílicos, y muchos lípidos, incluidos los sintéticos que se han descrito por su uso para facilitar la administración intracelular (ya sea para la aplicación in vitro o in vivo) cumplen esta definición. Un grupo de compuestos anfifílicos que han demostrado ser especialmente prometedores para la administración eficaz de moléculas biológicamente activas son los anfífilos catiónicos. Los anfífilos catiónicos tienen grupos polares que pueden estar cargados positivamente a un pH fisiológico o casi, y en la técnica se entiende que esta propiedad es importante a la hora de definir cómo interaccionan los anfífilos con muchos tipos de moléculas biológicamente activas, por ejemplo, polinucleótidos cargados negativamente como el ADN.

Ejemplos de compuestos anfifílicos catiónicos que está establecido son útiles para la administración intracelular de moléculas biológicamente activas se encuentran, por ejemplo, en las siguientes referencias, y cuyas descripciones se incorporan específicamente por referencia. Muchas de estas referencias contienen también descripciones útiles de las propiedades de los anfífilos catiónicos que, como se entiende en la técnica, los hacen adecuados para dichas aplicaciones, y de la naturaleza de las estructuras que, como también se entiende en la técnica, están formados por complejos de dichos anfífilos y moléculas terapéuticas destinadas a la administración intracelular.

(1) Feigner, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 – 7417 (1987) describen el uso de lípidos catiónicos sintéticos cargados positivamente, como cloruro de N-[1 (2, 3-dioleiloxi) propil]-N, N, N-trimetilamonio («DOTMA») , para formar complejos lípido/ADN adecuados para transfecciones. Véase también Feigner y col., The Journal of Biological Chemistr y , 269 (4) , 2550 – 2561 (1994) .

(2) Behr y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86, 6982 – 6986 (1989) describen varios anfífilos, como dioctadecilamidologlicilespermina («DOGS») .

(3) En la patente de EE. UU. 5.283.185 de Epand y col. se describen clases y especies adicionales de anfífilos, como 3º [N- (N1 , N1 -dimetilaminoetano) carbamoil] colesterol, denominado «DC-chol».

(4) En la patente de EE. UU. N.º 5.264.618 de Felgner y col. se describen compuestos adicionales que facilitan el transporte de moléculas biológicamente activas dentro de las células. Véase también Felgner y col., The Journal of Biological Chemistr y , 269 (4) , pág.... [Seguir leyendo]

1. Uso de un plásmido que comprende un gen de interés para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero mediante terapia génica, en el que el uso comprende la modificación del plásmido mediante la eliminación de un dinucleótido CpG o su mutación a un dinucleótido no-CpG de al menos un dinucleótido CpG dentro de dicho plásmido, y en el que el tratamiento comprende la administración del plásmido en combinación con un anfífilo catiónico.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que el uso comprende la eliminación de un dinucleótido CPG o su mutación a un dinucleótido no-CpG de al menos un dinucleótido CpG dentro del gen de interés.

3. El uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el plásmido comprende un origen de replicación, y el uso comprende la eliminación de un dinucleótido CpG o su mutación a un dinucleótido no-CpG de al menos un dinucleótido CpG dentro del origen de replicación.

4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, en el que el plásmido comprende un polinucleótido que codifica un marcador seleccionable, y el uso comprende la eliminación de un dinucleótido CpG o su mutación a un dinucleótido no-CpG de al menos un dinucleótido CpG dentro de dicho polinucleótido.

5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el transgén codifica la proteína reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (FQ) .

6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende un excipiente farmacéutico.

7. El uso según la reivindicación 6, en el que el uso comprende la liofilización del plásmido en presencia de dicho excipiente.

8. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende el anfífilo catiónico que tiene que ser administrado en combinación con el plásmido.

9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anfífilo catiónico es un lípido catiónico.

10. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el plásmido y el anfífilo catiónico tienen que administrarse juntos como solución en aerosol.

11. Un proceso de preparación de una composición farmacéutica para el uso de la terapia génica en un mamífero, en el que la composición farmacéutica comprende: i) un plásmido que comprende un gen de interés y ii) un anfífilo catiónico; y en el que el proceso comprende: a) modificar el plásmido mediante la eliminación de un dinucleótido CpG o su mutación a un dinucleótido no-CpG de al menos un dinucleótido CpG dentro del plásmido y b) combinar el plásmido con el anfífilo catiónico.