Procedimiento para mejorar la conservación de lactococos.

Una cepa aislada de Lactococcus sp. que comprende: (a) un gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogo,

o (b) un gen de trehalosa-6-fosfato sintasa y un gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogos, en los que la actividad trehalosa-6-fosfato fosforilasa está inactivada.

Procedimiento para mejorar la conservación de lactococos La presente invención se refiere a cepas de Lactococcus lactis con características de conservación mejoradas y tolerancia mejorada a ácidos y sales biliares. Más específicamente, la invención se refiere a una cepa de L. lactis que comprende un gen de trehalosa-6-fosfato sintasa y/o un gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogos, que da como resultado una acumulación de trehalosa en el citoplasma y/o en la membrana citoplasmática. Se refiere adicionalmente a una cepa de L. lactis en la que dicha acumulación de trehalosa da como resultado una concentración interna de trehalosa de al menos 10 mg por g de células (ph) .

Lactococcus lactis es una bacteria acidoláctica fermentadora mesófila y microaerófila. Aparece comúnmente en la naturaleza, especialmente en material vegetal. La bacteria se usa extensamente en fermentaciones alimentarias, especialmente en la industria láctea. Además, existe un interés creciente por su uso en nutracéuticos, como medicación para tratar infecciones vaginales o como portador para el suministro de moléculas activas biológicas. En todos estos casos, existe la necesidad de cultivos iniciadores altamente viables o de formulaciones farmacéuticas que comprendan una alta proporción de bacterias viables. Sin embargo, uno de los inconvenientes principales de L. lactis es su rápida caída de viabilidad durante el almacenamiento, o durante el procesamiento para la formación de comprimidos. La caída de viabilidad es aún más drástica cuando la bacteria después de liofilización se somete a una tensión adicional tal como una alta acidez o la presencia de sales biliares.

Se han propuesto varios procedimientos para superar este problema. Los intentos de mejorar la viabilidad se realizan tanto al nivel de condiciones de cultivo de las bacterias como al nivel de procesamiento. Gaudu et al. (2002) dan a conocer que lactococos cultivados por respiración sobreviven notablemente mejor después de un largo tiempo de almacenamiento que las células fermentadoras. Este largo tiempo de supervivencia es probablemente debido a la inducción de citocromos que pueden proteger a las células del estrés oxidativo. Li et al. (2003) demostraron que la presencia de glutation intracelular, que es también protector contra el estrés oxidativo, puede dar también como resultado una viabilidad mejorada tras el almacenamiento. Otro enfoque para mejorar la viabilidad de lactococos tras el almacenamiento se basa en la adaptación del proceso de secado por pulverización y en el uso de auxiliares de procesamiento tales como celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, hidroxipropimetilcelulosa acetato succinato o alginato de sodio, que pueden usarse para recubrir las partículas bacterianas.

Aunque estos procesos conducen ciertamente a una mejora del almacenamiento, ninguna de las soluciones es suficiente, y existe la necesidad adicional de procedimientos que puedan conducir a un almacenamiento mejorado de lactococos, especialmente en aquellos casos en que la bacteria se usa para el suministro de compuestos activos biológicos en aplicaciones médicas.

La trehalosa (α-D-glucopiranosil-1, 1-α-D-glucopiranósido) es un disacárido no reductor que aparece en una gran variedad de organismos, en el intervalo de bacterias a animales invertebrados. La trehalosa, a veces en combinación con dextrano, se usa a menudo como crioconservante añadido externamente. La trehalosa añadida externamente funciona como matriz de sacárido (Conrad et al., 2000) , y ejerce su efecto protector especialmente durante la liofilización, donde actúa como formador de cristal. Además, la trehalosa está bien reconocida como metabolito del estrés, y se ha estudiado extensamente en hongos, especialmente en Saccharomyces cerevisiae. Las altas concentraciones internas de trehalosa mejoran la capacidad de almacenamiento y dan como resultado una mayor viabilidad tras la crioconservación. Sin embargo, es importante observar que la trehalosa añadida externamente raramente conduce a una acumulación interna de trehalosa en microorganismos, porque no se capta o porque se metaboliza rápidamente después de la captación.

La trehalosa añadida externamente se ha usado, entre otros, para la conservación de lactobacilos durante la liofilización (Conrad et al., 2000) y para la estabilización de lactococos durante la congelación (documento EP 1441027) . Sin embargo, aunque el papel de la trehalosa interna en células eucarióticas está bien documentado, no existen datos disponibles sobre un papel positivo en la conservación de procariotas.

Padilla et al. (2004) han mostrado recientemente que puede obtenerse una sobreproducción de trehalosa en la bacteria grampositiva productora y secretora de trehalosa Cor y nebacterium glutanicum expresando los genes otsA y otsB de Escherichia coli en esta especie. Sin embargo, en este caso, la expresión de genes de E. coli conduce a un aumento de las actividades sintasa y fosfatasa endógenas y a un aumento de la producción de la trehalosa endógena existente. Además, el efecto de la sobreproducción de trehalosa sobre el almacenamiento de C. glutanicum es desconocido.

Lactococcus lactis es capaz de utilizar trehalosa (Andersson et al., 2001) , pero hasta ahora no se ha descrito una cepa de Lactococcus lactis sintetizadora de trehalosa. Es más, no se han identificado genes de trehalosa-6-fosfato sintasa ni trehalosa-6-fosfato fosfatasa, que son etapas esenciales en la producción de trehalosa a partir de glucosa6-fosfato, un metabolito que está presente en L. lactis. Sorprendentemente, se ha encontrado que, mediante la transferencia y expresión en L. lactis de los genes otsA (trehalosa-6-fosfato sintasa) y otsB (trehalosa-6-fosfato fosfatasa) de Escherichia coli, puede obtenerse una acumulación significativa de trehalosa. Aún más sorprendentemente, esta acumulación de trehalosa conduce a una mejora importante de la viabilidad en condiciones La presente invención proporciona un objeto como se expone en una cualquiera de (i) a (xiii) a continuación:

(i) Una cepa de Lactococcus sp. aislada que comprende:

(a) un gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogo, o

(b) un gen de trehalosa-6-fosfato sintasa y un gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogos,

en la que la actividad trehalosa-6-fosfato fosforilasa está inactivada.

(ii) Una cepa de Lactococcus sp. aislada según (i) , en la que uno o ambos genes de (a) o (b) están ligados operativamente al promotor de L. lactis inducible por nisina.

(iii) Una cepa de Lactococcus sp. aislada según (i) , en la que uno o ambos genes de (a) o (b) están ligados funcionalmente al promotor P1 constitutivo.

(iv) Una cepa de Lactococcus sp. aislada según cualquiera de (i) - (iii) , en la que el gen de trehalosa-615 fosfato sintasa heterólogo es el gen OtsA de Escherichia coli.

(v) Una cepa de Lactococcus sp. aislada según cualquiera de (i) - (iv) , en la que el gen de trehalosa-6fosfato fosfatasa heterólogo es el gen OtsB de Escherichia coli.

(vi) Una cepa de Lactococcus sp. aislada según cualquiera de (i) - (v) precedentes, en la que dicho Lactococcus sp. es Lactococcus lactis.

(vii) El uso de la acumulación de trehalosa en el citoplasma y/o la membrana citoplasmática de Lactococcus sp. para mejorar sus características de almacenamiento, para mejorar su resistencia a condiciones ácidas, para mejorar su resistencia a sales biliares o para mejorar su resistencia al estrés combinado, en el que dicha cepa de Lactococcus sp. aislada comprende:

(a) un gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogo, o (b) un gen de trehalosa-6-fosfato sintasa y un gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogos.

(viii) El uso de la acumulación de trehalosa en el citoplasma y/o la membrana citoplasmática de Lactococcus sp. para mejorar la resistencia al estrés combinado según (vii) , en el que dicho estrés combinado es una combinación de liofilización con condiciones ácidas y/o sales biliares.

(ix) El uso de la acumulación de trehalosa en el citoplasma y/o la membrana citoplasmática de Lactococcus sp. según cualquiera de (vii) - (viii) , en el que la actividad trehalosa-6-fosfato fosforilasa está inactivada.

(x) El uso de la acumulación de trehalosa en el citoplasma y/o la membrana citoplasmática de Lactococcus sp. según cualquiera de (vii) - (ix) , en el que el gen de trehalosa-6-fosfato sintasa 35 heterólogo es OtsA de Escherichia coli.

(xi) El uso de la acumulación de trehalosa en el citoplasma y/o la membrana citoplasmática de Lactococcus sp. según cualquiera de (vii) - (x) , en el que el gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogo es el gen OtsB... [Seguir leyendo]

1. Una cepa aislada de Lactococcus sp. que comprende:

(a) un gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogo, o

(b) un gen de trehalosa-6-fosfato sintasa y un gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogos, 5 en los que la actividad trehalosa-6-fosfato fosforilasa está inactivada.

2. Una cepa aislada de Lactococcus sp. según la reivindicación 1, en la que uno o ambos genes de (a) o (b) están ligados operativamente con el promotor de L. lactis inducible por nisina.

3. Una cepa aislada de Lactococcus sp. según la reivindicación 1, en la que uno o ambos genes de (a) o (b) están ligados funcionalmente con el promotor constitutivo P1.

4. Una cepa aislada de Lactococcus sp. según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el gen de trehalosa-6-fosfato sintasa heterólogo es el gen OtsA de Escherichia coli.

5. Una cepa aislada de Lactococcus sp. según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogo es el gen OtsB de Escherichia coli.

6. Una cepa aislada de Lactococcus sp. según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho 15 Lactococcus sp. es Lactococcus lactis.

7. El uso de la acumulación de trehalosa en el citoplasma y/o membrana citoplasmática de Lactococcus sp. para mejorar su resistencia a condiciones ácidas y/o para mejorar su resistencia a sales biliares, en el que dicha cepa aislada de Lactococcus sp. comprende:

(a) un gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogo, o 20 (b) un gen de trehalosa-6-fosfato sintasa y un gen de trehalosa-6-fosfato fosfatasa heterólogos.

8. El uso de la acumulación de trehalosa en el citoplasma y/o la membrana citoplasmática de Lactococcus sp. según la reivindicación 7 para mejorar la resistencia al estrés combinado, en el que dicho estrés combinado es una combinación de liofilización con condiciones ácidas y/o sales biliares.

9. El uso de la acumulación de trehalosa en el citoplasma y/o la membrana citoplasmática de Lactococcus sp. 25 según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en el que la actividad trehalosa-6-fosfato fosforilasa está inactivada.

10. El uso de la acumulación de trehalosa en el citoplasma y/o la membrana citoplasmática de Lactococcus sp. según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que el gen de trehalosa-6-fosfato sintasa heterólogo es el gen OtsA de Escherichia coli.

11. El uso de la acumulación de trehalosa en el citoplasma y/o la membrana citoplasmática de Lactococcus sp.

según cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en el que el gen de trehalosa-6-fosfato sintasa heterólogo es el gen OtsB de Escherichia coli.

12. El uso de la acumulación de trehalosa en el citoplasma y/o la membrana citoplasmática de Lactococcus sp. según cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en el que dicho Lactococcus sp es L. Lactis.

13. El uso de una cepa aislada de Lactococcus según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la 35 preparación de un medicamento para el suministro de una molécula profiláctica y/o terapéutica.

Fig. 1

Fig. 2 Fig. 4:

Fig. 5: Fig. 7: Fig. 9: Fig. 11: