Crioprotectores para la liofilización de las bacterias de ácido láctico.

Una combinación de compuestos estabilizantes para mejorar la supervivencia y estabilidad de las bacterias de ácido láctico liofilizadas,

que comprende un hidrolizado de almidón, una sal de ácido glutámico y un poliol.

Crioprotectores para la liofilización de las bacterias de ácido láctico.

La presente invención se relaciona con el uso de una nueva combinación de crioprotectores para aumentar la viabilidad de las bacterias de ácido láctico después de la liofilización, mejorando la textura de la torta liofilizada para un triturado más fácil y mejorar la estabilidad a largo plazo de las bacterias liofilizadas a diferentes condiciones de temperatura.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención pertenece al campo de la producción de bacterias liofilizadas, particularmente bacterias de ácido láctico. Más particularmente, la invención se relaciona con el uso de una nueva combinación de crioprotectores para aumentar la viabilidad de las bacterias después de la liofilización, mejorando la textura de la torta liofilizada para un triturado más fácil y mejorar la estabilidad a largo plazo de las bacterias liofilizadas a diferentes condiciones de temperatura. La invención se relaciona adicionalmente con el uso de tales bacterias liofilizadas en la industria alimentaria o en aplicaciones para la salud humana o animal. Más particularmente, la invención se relaciona con el aumento de la viabilidad y el almacenamiento a largo plazo de bacterias recombinantes capaces de expresar proteínas o péptidos heterólogos y administradas a seres humanos o animales con fines terapéuticos o de vacunación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las bacterias de ácido láctico (LAB) son un grupo de bacterias Gram-positivas taxonómicamente diversas, capaces de convertir hidratos de carbono fermentables principalmente a ácido láctico, lo que acidifica el medio de crecimiento en el proceso. Generalmente, las especies de LAB son más conocidas por su uso en la industria alimentaria, principalmente en la preparación de alimentos fermentados tales como los productos lácteos y ciertos tipos de carne. La importancia comercial de la industria de la fermentación láctea, que abarca la producción de por ejemplo queso, yogur y crema ácida, es bien conocida en todo el mundo.

En las últimas décadas, el interés por las LAB se ha incrementado dramáticamente. El hecho de que cepas seleccionadas de LAB pueden influir en la fisiología intestinal es ampliamente reconocido. Ha habido un creciente interés por L. lactis como huésped para la producción de proteínas heterólogas, y eventualmente para la producción in situ y como sistema de suministro de moléculas biológicamente activas (ver más abajo) .

En la actualidad, se ha dirigido mucho esfuerzo hacia el uso de especies de LAB modificadas genéticamente (GM) como herramientas de producción y suministro para la administración de fármacos biológicos por vía tópica, a la mucosa, que incluye citoquinas, fragmentos de anticuerpos, factores de crecimiento, hormonas y neuropéptidos. (por ejemplo, [6-12]) . Particularmente, se eligió la bacteria de grado alimenticio genéticamente modificada Lactococcus lactis (L. lactis) como el microorganismo preferido para el suministro terapéutico de polipéptidos biológicamente activos. Claramente, el concepto de suministro por vía oral de una proteína terapéutica con cepas de L. lactis modificadas genéticamente abre posibilidades emocionantes. Sin embargo un atributo necesario de cualquier producto farmacéutico es la estabilidad a largo plazo (vida en estante) , típicamente al menos 24 meses bajo condiciones de almacenamiento predefinidas. Para este fin, se necesita desarrollar una plataforma de fabricación eficiente, escalable y confiable para formulaciones de Sustancia Fármaco (DS) y Producto Fármaco (DP) basadas en L. lactis genéticamente modificadas.

Durante la fabricación y el almacenamiento posterior, el parámetro crítico para la estabilidad del producto es la viabilidad a largo plazo de las bacterias genéticamente modificadas (expresada normalmente como unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo en función del tiempo de almacenamiento) . La fabricación, el almacenamiento y el probable uso terapéutico de las cepas de LAB imponen un estrés significativo a las bacterias [4]. En entornos industriales, las LAB puede preservarse y distribuirse en forma líquida, secada por aspersión, congeladas o liofilizadas (congeladas y secadas) . Aunque puede ser adecuado el uso de todas estas preparaciones como cultivos iniciales en la industria alimentaria, cada vez se pone más énfasis en los métodos de conservación a largo plazo que promuevan una viabilidad celular y una actividad metabólica elevadas, ya que estos parámetros se consideran un requisito previo para las aplicaciones (bio) farmacéuticas. Con el fin de maximizar la supervivencia, la adición a la biomasa de crioprotectores seleccionados y la posterior liofilización son etapas cruciales, especialmente considerando el hecho de que las bacterias viables y metabólicamente activas son un requisito absoluto para inducir el efecto terapéutico deseado in situ.

La liofilización es ampliamente considerada como uno de los procesos de deshidratación más adecuados para bacterias, con el objetivo de lograr una formulación final sólida y estable [4]. Es uno de los métodos más comunes para almacenar cultivos de células microbianas, aún cuando las tasas de supervivencia después de la liofilización y durante el almacenamiento pueden variar entre cepas [5]. La supervivencia después de la liofilización refleja la capacidad de las células para resistir los efectos de congelación y secado rápidos, tales como la oxidación de lípidos de membrana y el daño celular en varios sitios diana [5]. Es bien conocido que la liofilización de bacterias sin protección mata la mayoría de ellas, y aquellas que sobreviven, mueren rápidamente tras el almacenamiento. Por lo tanto se han realizado varios intentos para aumentar el número de bacterias sobrevivientes tras la liofilización y el almacenamiento, con un éxito limitado (ver más abajo) .

La liofilización es con mucho, si no exclusivamente, el método más frecuentemente utilizado para lograr una vida en estante a largo plazo [16]. La elección de una mezcla adecuada de medio de secado/crioprotector es crítica para aumentar la tasa de supervivencia de las LAB durante la liofilización y posterior almacenamiento [4]. Se han informado varios estudios que intentan aumentar la tasa de supervivencia de las LAB durante la liofilización y/o posterior almacenamiento (para una revisión, ver [4]) . Sin embargo, ninguna de estas publicaciones demuestran una suficiente estabilidad a largo plazo (es decir > 80% de supervivencia después de un año) de las bacterias liofilizadas, como se requiere para las aplicaciones farmacéuticas, particularmente a temperatura ambiente (25 °C) o a 2 - 8 °C

Para la mayoría de los cultivos de LAB de interés comercial para la industria láctea, la leche desnatada en polvo se selecciona como medio de secado porque estabiliza los constituyentes de las membranas celulares, facilita la rehidratación y forma un revestimiento protector sobre las células [4]. Suplementar la leche desnatada con agentes crioprotectores adicionales puede aumentar su efecto protector intrínseco. Font de Valdez y otros describen el efecto protector del adonitol al 10% en leche desnatada, sobre 12 cepas de LAB sometidas a liofilización [17]. Aunque se informan elevadas tasas de supervivencia durante la liofilización (que varían de 42-100%, dependiendo de la cepa) , no se proporcionaron datos sobre la estabilidad a largo plazo. Castro y otros evaluaron los efectos beneficiosos de la leche desnatada (11%) o la trehalosa (5%) sobre la supervivencia de Lactobacillus bulgaricus después de la liofilización, mostrando tasas de retención del 25% (conteo de células viables) en comparación con ̱ 1% en agua sola [18]. Nuevamente, no se informaron datos sobre la estabilidad durante el almacenamiento posterior.

Carvalho y otros (2003) demostraron el efecto estabilizador tanto del sorbitol como del glutamato (mono) sódico (MSG) , cada uno añadido por separado a las LAB suspendidas en leche desnatada, sobre la supervivencia durante la liofilización y posterior almacenamiento de 3-6 meses [19]. Sin embargo, a pesar del hecho de que la estabilidad se incrementó en comparación con la leche desnatada sola, las tasas de supervivencia informadas en presencia de sorbitol

o MSG eran todavía muy bajas (<0.1%) . Además, la supervivencia a largo plazo de las células liofilizadas, almacenadas en recipientes cerrados a 20 °C al aire y mantenidas en la oscuridad hasta 8 meses, mostró una disminución significativa de uno o más registros en el tiempo.

Carcoba y Rodríguez estudiaron los efectos de diversos compuestos, añadidos de manera individual a la leche desnatada reconstituida (RSM) , sobre la supervivencia... [Seguir leyendo]

1. Una combinación de compuestos estabilizantes para mejorar la supervivencia y estabilidad de las bacterias de ácido láctico liofilizadas, que comprende un hidrolizado de almidón, una sal de ácido glutámico y un poliol.

2. La combinación de acuerdo con reivindicación 1 en donde;

- la cantidad de hidrolizado de almidón está en el intervalo de aproximadamente 2, 0% a aproximadamente 10% (p/v) ;

- la cantidad de sal de ácido glutámico está en el intervalo de aproximadamente 2, 0% a aproximadamente 10% (p/v) ; y

- la cantidad de poliol está en el intervalo de aproximadamente 5, 0 a aproximadamente 30% (p/v) .

3. La combinación de compuestos estabilizantes de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la sal del ácido glutámico es un glutamato sódico.

4. La combinación de compuestos estabilizantes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el poliol es sorbitol o manitol.

5. La combinación de compuestos estabilizantes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el hidrolizado de almidón es un dextrano.

6. Un método para la liofilización de una bacteria de ácido láctico, en donde una combinación de los compuestos estabilizantes se usa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Una bacteria de ácido láctico liofilizada, que comprende además una combinación de los compuestos estabilizantes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

8. Una bacteria de ácido láctico liofilizada de acuerdo con la reivindicación 7 en donde dicha bacteria de ácido láctico comprende además uno o más ácidos nucleicos recombinantes que son heterólogos para la bacteria.

9. Una bacteria de ácido láctico liofilizada de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para usar como un medicamento

o como un ingrediente alimenticio.

10. Una bacteria de ácido láctico liofilizada de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para usar aplicaciones alimenticias o procesamiento de alimentos.

11. Una bacteria de ácido láctico liofilizada de acuerdo con la reivindicación 10 que está en forma de una composición de cultivo inicial para la producción de un producto alimenticio o un alimento animal, o en forma de un cultivo para la producción de un aroma.

12. Una combinación de compuestos estabilizantes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las bacterias de ácido láctico se seleccionan del grupo que consiste de una especie de Lactococcus, una especie de Lactobacillus, una especie de Streptococcus, una especie de Pediococcus, una especie de Bifidobacterium y una especie de Leuconostoc.

13. Un método para liofilizar bacterias de ácido láctico de acuerdo con la reivindicación 6, en donde las bacterias de ácido láctico se seleccionan del grupo que consiste de una especie de Lactococcus, una especie de Lactobacillus, una especie de Streptococcus, una especie de Pediococcus, una especie de Bifidobacterium y una especie de Leuconostoc.

14. Una bacteria liofilizada de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 10, en donde las bacterias de ácido láctico se seleccionan del grupo que consiste de una especie de Lactococcus, una especie de Lactobacillus, una especie de Streptococcus, una especie de Pediococcus, una especie de Bifidobacterium y una especie de Leuconostoc.