Mejora del rendimiento en la expresión de proteínas en sistemas de síntesis de proteínas en ausencia de células mediante la adición de agentes antiespumantes.

Un procedimiento para la traducción in vitro de ARNm en ausencia de células para producirpolipéptidos,

el procedimiento que comprende la síntesis de dichos polipéptidos en una mezcla de reacción enausencia de células con un volumen superior a 15 μl, que comprende un agente antiespumante distinto de undetergente en una concentración de al menos el 0,00007 %, y no superior al 0,007 % en peso en donde el agenteantiespumante se selecciona entre: copolímeros en bloque, que proporcionan una acción desespumante /antiespumante formando una monocapa insoluble en la interfaz del aire / agua de la espuma; glicoléteres dealquilpolioxialquileno; polímeros de siloxano; y mezclas de dispersiones de poliéter basadas en polipropilenoorgánico no siliconado.

Mejora del rendimiento en la expresión de proteínas en sistemas de síntesis de proteínas en ausencia de células mediante la adición de agentes antiespumantes

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La síntesis de proteínas es un proceso biológico fundamental, que subyace en el desarrollo de polipéptidos terapéuticos, diagnósticos y catalizadores. Con la llegada de la tecnología del ADN recombinante (ADNr) se ha conseguido aprovechar la maquinaria catalítica de la célula para producir una proteína deseada. Esto se puede conseguir dentro del entorno celular o in vitro utilizando extractos procedentes de células.

A lo largo de la década pasada, la productividad de sistemas en ausencia de células se ha mejorado en dos órdenes de magnitud, desde 5 µg/ml•h aproximadamente a 500 µg/ml•h aproximadamente. Este logro ha convertido la síntesis de proteínas in vitro en una técnica práctica para la investigación a escala de laboratorio y proporciona una plataforma tecnológica para la expresión de alto rendimiento de proteínas. También comienza a apuntar la posibilidad de uso de tecnologías en ausencia de células como alternativa a la producción in vivo a gran escala de compuestos farmacéuticos proteicos.

La síntesis de proteínas en ausencia de células ofrece numerosas ventajas sobre los procedimientos convencionales de expresión de proteínas in vivo. Los sistemas en ausencia de células pueden dirigir la mayor parte de, sino todos, los recursos metabólicos de la célula hacia la producción exclusiva de una proteína. Además, la ausencia de pared celular in vitro es una ventaja puesto que permite un mejor control del entorno de síntesis. Por ejemplo, los niveles de ARNt pueden variar para reflejar la utilización codónica de los genes expresados. Además, se puede alterar el potencial redox, el pH, o la fuerza iónica con una mayor flexibilidad que in vivo puesto que el crecimiento o la viabilidad celular no suponen una preocupación. Por otra parte, se puede conseguir fácilmente la recuperación directa de los productos proteicos purificados y convenientemente plegados.

La traducción in vitro también tiene reconocimiento por su capacidad para incorporar aminoácidos no naturales y marcados isotópicamente así como por su capacidad para producir proteínas que son inestables, insolubles o citotóxicas in vivo. Además, la síntesis de proteínas en ausencia de células puede desempeñar un papel revolucionario en tecnologías de ingeniería de proteínas y de selección proteómica. El procedimiento en ausencia de células circunda los procesos laboriosos necesarios para la clonación y transformación de células para la expresión de nuevos productos génicos in vivo, y se está convirtiendo en una plataforma tecnológica para este campo.

A pesar de todas las características prometedoras de la síntesis de proteínas en ausencia de células, su utilización práctica e implementación a gran escala ha estado limitada por diversos obstáculos. Preponderantes entre estos obstáculos se encuentran los cortos periodos de reacción y las bajas tasas de producción de proteínas, que dan lugar a malos rendimientos en la síntesis de proteínas y un coste en reactivos elevado. El trabajo pionero de Spirin y col. (1988) Science 242: 1162 – 1164 sorteó inicialmente el problema de los cortos periodos de reacción con el desarrollo de un sistema de flujo continuo. Muchos laboratorios han duplicado y mejorado este trabajo, pero todos ellos han utilizado principalmente procedimientos que suministran sustratos de manera constante a la cámara de reacción. Este enfoque incrementa la duración de la reacción de traducción y el rendimiento proteico en comparación con el sistema discontinuo. No obstante, es ineficiente por su utilización de reactivos caros, generalmente produce un producto diluido, y no ha proporcionado mejoras significativas en las tasas de producción.

El sistema discontinuo convencional ofrece diversas ventajas sobre estos esquemas continuos y semicontinuos, que incluye una fácil escalabilidad, reproducibilidad, mejores tasas de producción de proteínas, conveniencia, aplicabilidad para formatos multiplexados para la expresión de alto rendimiento, y un uso del sustrato más eficiente. Estas ventajas hacen que la mejora de la productividad del sistema discontinuo sea crucial para la utilización industrial de síntesis de proteínas en ausencia de células. No obstante, utilizando la metodología actual, se produce una pérdida de eficiencia cuando las reacciones se llevan a cabo a mayor escala. La reducción en el rendimiento de productos proteicos específicos es especialmente grave en sistemas que requieren oxígeno para la fosforilación oxidativa. El incremento del rendimiento del producto en reacciones más grandes es un componente esencial para satisfacer esta necesidad.

Bibliografía relevante [0007] Patente de EE.UU 6.337.191 B1, Swartz y col. Kim y Swartz (2000) Biotechnol Prog. 16: 385 – 390; Kim y Swartz (2000) Biotechnol Lett. 22: 1537 – 1542; Kim y Choi (2000) J Biotechnol. 84: 27 – 32; Kim y col. (1996) Eur J Biochem. 239: 881 – 886; Tao y Levy (1993) Nature 362: 755 – 758; Hakim y col. (1996) J Immun. 157: 5503 – 5511; Pratt (1984) Coupled transcription-translation in prokar y otic cell-free systems. In: Hames BD, Higgins SJ. Ed. In transcription and translation: a practical approach. Nueva York: IRL press: 179 – 209.; Davanloo y col. (1984) PNAS

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RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Las composiciones y procedimientos se proporcionan para la síntesis in vitro de moléculas biológicas en mezclas de reacción que comprenden agentes antiespumantes. La adición de agentes antiespumantes a las reacciones de síntesis en ausencia de células mejora el rendimiento específico de las proteínas en sistemas en ausencia de células. En una forma de realización de la invención, la mezcla de reacción que comprende un agente antiespumante es una reacción a mayor escala, por ejemplo, a volúmenes de reacción superiores a, al menos, 15 µl aproximadamente. Las reacciones se pueden llevar a cabo en diversos reactores, como es bien sabido en la técnica, que incluyen reactores de columna de burbujeo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es una gráfica que representa el rendimiento proteico en reacciones que comprenden diferentes agentes antiespumantes.

La Figura 2 es un esquema de un reactor de burbujeo.

La Figura 3 es una gráfica que representa los rendimientos de la proteína GMCSF-scFv en una columna de burbujeo con volúmenes de reacción totales de 1500 µl, en comparación con una reacción de 15 µl.

La Figura 4 es una gráfica que representa los rendimientos en una columna de burbujeo con un volumen de reacción de 2000 µl, en comparación con la reacción en una película delgada de 200 µl, y una reacción en un tubo Eppendorf de 15 µl. Con la adición de un antiespumante, el rendimiento específico en cada sistema es comparable.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN

Se proveen composiciones como se define en la reivindicación 12 y procedimientos como se define en la reivindicación 1 para la síntesis in vitro de moléculas biológicas en mezclas de reacción que comprenden agentes antiespumantes para mejorar el rendimiento total, soluble, y activo de proteínas sintetizadas en sistemas en ausencia de células. La adición de antiespumante puede incrementar el rendimiento en reacciones a pequeña escala, pero es particularmente beneficiosa en reacciones a mayor escala, especialmente en reactores que proporcionan condiciones aeróbicas.

La síntesis in vitro, como se utiliza en el presente documento, se refiere a la síntesis en ausencia de células de macromoléculas biológicas en una mezcla de reacción que comprende extractos biológicos y/o reactivos definidos. La mezcla de reacción comprenderá un molde para la producción de la macromolécula, por ejemplo, ADN, ARNm, etc.; monómeros para la síntesis de la macromolécula, por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos, etc., y cofactores, enzimas y otros reactivos que sean necesarios para la síntesis, por ejemplo, ribosomas, ARNt, polimerasas, factores de transcripción, etc. Dichos sistemas de reacción sintéticos son muy conocidos en la materia, y han sido descritos en la bibliografía. En los procedimientos de la invención se pueden utilizar una serie de químicas de reacción para la síntesis de polipéptidos. Por ejemplo,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la traducción in vitro de ARNm en ausencia de células para producir polipéptidos, el procedimiento que comprende la síntesis de dichos polipéptidos en una mezcla de reacción en ausencia de células con un volumen superior a 15 µl, que comprende un agente antiespumante distinto de un detergente en una concentración de al menos el 0, 00007 %, y no superior al 0, 007 % en peso en donde el agente antiespumante se selecciona entre: copolímeros en bloque, que proporcionan una acción desespumante / antiespumante formando una monocapa insoluble en la interfaz del aire / agua de la espuma; glicoléteres de alquilpolioxialquileno; polímeros de siloxano; y mezclas de dispersiones de poliéter basadas en polipropileno orgánico no siliconado.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el agente antiespumante es un copolímero en bloque.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho copolímero en bloque es un tensioactivo PLURONIC™.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha mezcla de reacción comprende un volumen superior a 100 µl aproximadamente.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha mezcla de reacción comprende un volumen superior a 1000 µl aproximadamente.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 – 5, en el que dicha mezcla de reacción tiene un rendimiento que es de al menos el 90 % del rendimiento en una reacción comparable a pequeña escala.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 6, en el que se infunde oxígeno gaseoso en la mezcla de reacción en ausencia de células.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 7, en el que dicha síntesis se lleva a cabo en un reactor.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el reactor es un reactor de burbujeo.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el procedimiento comprende adicionalmente la transcripción in vitro de ARNm a partir de un molde de ADN.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la mezcla de reacción comprende un extracto biológico; un molde para la producción del ARNm y/o el polipéptido; monómeros para el ARNm y/o el polipéptido a sintetizar; y cofactores, enzimas y otros reactivos que sean necesarios para la síntesis.

12. Una mezcla de reacción para la traducción in vitro de ARNm para producir polipéptidos, que comprende un extracto biológico; un molde para la producción del polipéptido; monómeros para el polipéptido a sintetizar; y cofactores, enzimas y otros reactivos que sean necesarios para la síntesis; y un agente antiespumante distinto de un detergente a una concentración de al menos el 0, 00007 %, y no superior al 0, 007 % en peso en la que el agente antiespumante se selecciona entre: copolímeros en bloque, que proporcionan una acción desespumante / antiespumante formando una monocapa insoluble en la interfaz del aire / agua de la espuma; glicoléteres de alquilpolioxialquileno; polímeros de siloxano; y mezclas de dispersiones de poliéter basadas en polipropileno orgánico no siliconado.

13. La mezcla de reacción de la reivindicación 12, en la que el agente antiespumante es un copolímero en bloque.

14. La mezcla de reacción de la reivindicación 13, en la que dicho copolímero en bloque es un tensioactivo PLURONIC™.

15. La mezcla de reacción de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 que comprende adicionalmente un molde de ADN, monómeros, enzimas y reactivos para la producción del ARNm.