Materiales para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaria (alternariol y alternariol monometil éter).

Materiales para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaria (alternariol y alternariol monometil éter).

El alternariol y el aternariol monometil éter son dos de las toxinas producidas en mayor grado por hongos de la familia Alternaria. Se encuentran con frecuencia en alimentos y su consumo continuado puede tener efectos negativos en la salud humana por lo que es importante el desarrollo de métodos de detección eficaz que evite su introducción en la cadena alimentaria. En esta invención se describe un método para la preparación de materiales poliméricos orgánicos que actúan como adsorbentes selectivos de alternariol y alternariol monometil éter. Los polímeros emplean como plantillas moléculas de estructura análoga a las micotoxinas, sencillas de preparar, robustas y baratas. Se pueden utilizar en la determinación de micotoxinas de Alternariol presentes en aguas, alimentos, hortalizas, frutos y derivados (zumos, mostos, vinos...) y otras matrices donde se puedan encontrar presentes.

Materiales para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaría (alternariol y alternariol monometil éter)

Resumen Materiales para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaría (aiternariol y alternariol monometil éter)

El alternariol y el aternariol monometil éter son dos de las toxinas producidas en mayor grado por hongos de la familia Alternaría. Se encuentran con frecuencia en alimentos y su consumo continuado puede tener efectos negativos en la salud humana por lo que es importante el desarrollo de métodos de detección eficaz que evite su introducción en la cadena alimentaria. En esta invención se describe un método para la preparación de materiales poliméricos orgánicos que actúan como adsorbentes selectivos de alternariol y alternariol monometil éter. Los polímeros emplean como plantillas moléculas de estructura análoga a las micotoxinas, sencillas de preparar, robustas y baratas. Se pueden utilizar en la determinación de micotoxinas de Alternariol presentes en aguas, alimentos, hortalizas, frutos y derivados (zumos, mostos, vinos ... ) y otras matrices donde se puedan encontrar presentes.

Objeto y campo de la invención La invención se refiere a materiales capaces de reconocer y unir selectivamente micotoxinas y su método de preparación. De manera más concreta, la invención se refiere a polímeros de impronta molecular para reconocer de forma selectiva las toxinas alternariol y alternariol monometil éter así como su método de preparación empleando moléculas análogas como plantillas.

Los polímeros objeto de la presente invención son útiles para la determinación de alternariol y alternariol monometil éter en aguas, hortalizas, frutas, alimentos, derivados y otras matrices donde se puedan encontrar presentes dichas toxinas.

Estado de la técnica La existencia de hongos en alimentos mal almacenados (frutas, cereales, etc.) puede dar lugar a la presencia de toxinas que pasan inadvertidas en muchos alimentos. El consumo continuado de estos alimentos implica un riesgo para la salud humana, por lo que es importante el desarrollo de métodos de detección y cuantificación de las mismas.

Las especies de hongos de la familia Alternaría producen un elevado número de metabolitos secundarios. Siete toxinas principales, que pertenecen a tres clases estructurales diferentes, son conocidas como posibles contaminantes de alimentos con un riesgo toxicológico potencial. Éstas son: alternariol, alternariol monometil éter, altenueno, alterotoxinas 1, 11 y 111 y ácido tenuazónico. El alternariol (AOH) y el alternariol monometil éter (AME) son las micotoxinas más relevantes producidas por hongos Alternaría. Los hongos Alternaría a su vez, son los que más comúnmente se pueden encontrar en alimentos como granos de cereales, frutas y vegetales. Los tomates, por ejemplo, son uno de los productos más afectados por la contaminación con AOH y AME, pudiéndose encontrar niveles de AOH de 25 J.tg/kg y de AME de 5 J.!glkg en pastas de tomate concentradas (S. Asam, K. Konitzer, M. Rychlik, Mycotox. Res. 2011, 27, 23-28) .

Los procedimientos de extracción de AOH y AME en métodos analíticos incluyen, por ejemplo, la extracción en fase sólida (SPE) . Los métodos de determinación de dichas especies más empleados son la cromatografía en capa fina (TLC}, cromatografía de gases (GC) y, sobre todo, la cromatografía líquida (LC) con detección UV, fluorescente o electroquímica (V. Fernández Pinto, en Mycotoxins in Fruits and Vegetables, R. Barkai-Golan, N. Paster, Academic Press, 2008, capítulo 13, p. 271-278)

Actualmente, en la mayoría de casos, la determinación de AOH y AME se realiza mediante métodos cromatográficos que requieren de instrumentación compleja y cara y personal especializado para su manejo.

Un método alternativo para su determinación es el empleo de inmunoensayos, recientemente descrito en la literatura (A A Burkin y G. P. Kononenko, Appl. Biochem. Micro+, 2011, 47, 72-76; Y. Ackermann, V. Curtui, R. Dietrich, M. Gross,

H. Latif, E. Martlbauer, E. Usleber, J. Agríe. Food Chem. 2011, 59, 6360-6368) , si bien requiere el empleo de sistemas biológicos de reconocimiento que son más difíciles y más caros de producir, menos estables y menos robustos que los polímeros sintéticos.

En la presente invención se describen soportes sólidos y materiales poliméricos en distintos formatos para la coordinación selectiva de AOH y AME como moléculas diana empleando polímeros de impronta molecular (también denominados MIPs, del término en inglés molecular/y imprinted polymers) como elementos de 1 O reconocimiento sintéticos.

En el documento WO 2011/031562 se describe la preparación de polímeros de impronta molecular para secuestrar o adsorber micotoxinas como compuestos diana. De forma más concreta, se describe la síntesis de moléculas plantilla análogas a ocratoxina A y esporidesmina.

Descripción de la invención Los polímeros de impronta molecular son materiales que mimetizan en un cierto grado las propiedades de moléculas biológicas como los anticuerpos o las enzimas en cuanto a que poseen cavidades que son capaces de reconocer y enlazar selectivamente un cierto compuesto o familia de compuestos de estructura similar. Por esta razón se les conoce también como "plasticuerpos", con la ventaja de que estos materiales se pueden obtener de forma más sencilla y, además, son más económicos y robustos, ya que poseen mucha mayor estabilidad físico-química que los receptores biológicos.

Los MIPs se preparan en presencia de la molécula que se quiere reconocer, en este caso, AOH o AME, de manera que durante la etapa de polimerización, los monómeros de partida se organizan alrededor de dicha molécula mediante interacciones reversibles. Una vez ha transcurrido la polimerización, el material se lava minuciosamente con el disolvente apropiado para la extracción de la molécula plantilla, quedando cavidades en el material que son complementarias en tamaño,

forma y propiedades químicas al analito. Este material con cavidades selectivas se puede utilizar entonces para la extracción (o preconcentración) de la molécula de interés presente en una muestra compleja. Desarrollando el procedimiento adecuado, el soporte polimérico puede utilizarse también para su aplicación en sensores.

Hay ocasiones en las que no es conveniente utilizar el propio analito a determinar como molécula plantilla en la síntesis de MIPs, ya que puede tratarse de una sustancia tóxica, peligrosa o muy cara (normalmente se requieren cantidades del orden de 1 O mg a 1 g para preparar una serie completa de polímeros de ensayo y muchísimo más si se trata de una producción industrial) . En estos casos, se recurre al empleo de moléculas análogas o sucedáneas, que imitan en el mayor grado posible las propiedades estructurales y químicas de la molécula diana, pero que son menos peligrosas o más sencillas de preparar.

En este caso, tanto el AOH como AME son compuestos tóxicos y de un elevado precio. Por otro lado, la síntesis completa del AOH no es un procedimiento conveniente, ya que se trata de una compleja síntesis en 7 pasos (K. Koch, J. Podlech, E. Pfeiffer, M. Metzler, J. Org. Chem. 2005, 70, 3275-3276) .

El empleo de moléculas sucedáneas tiene una ventaja adicional. En ocasiones la plantilla utilizada durante la síntesis de los MIPs no puede ser extraída o lavada del material completamente, y el residuo que permanece unido al polímero puede ir liberándose gradualmente durante su uso o aplicación analítica posterior. Esto supone una grave interferencia en las medidas analíticas. Al utilizar moléculas distintas a AME ó AOH, se puede evitar el problema, ya que presentarán distintos tiempos de retención en cromatografía, o propiedades ópticas diferenciadas. Por ejemplo, en esta invención se preparan y utilizan moléculas plantilla análogas a AOH y AME que no tienen una estructura rígida (52-AME y 52-AOH en la Figura 2 o sus sales resultantes del tratamiento de la molécula plantilla con uno o más equivalentes de base capaz de reaccionar con grupos hidroxilo fenólicos como, por ejemplo, una sal de amonio cuaternario) y, por tanto, no son fluorescentes, con lo que se elimina la fluorescencia residual en el caso de un polímero en el que no se hubiese extraído cuantitativamente la micotoxina tras la preparación del mismo.

En la presente invención se describe la preparación de polímeros de impronta molecular selectivos para el reconocimiento o extracción de AOH y AME empleando moléculas sucedáneas para la impronta de los polímeros en lugar de AOH o AME. Estas moléculas sucedáneas son muy sencillas de preparar a escala cuantitativa de gramos... [Seguir leyendo]

1. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas 5

de Alternaría preparados en presencia de una plantilla molecular donde dicha plantilla es una molécula de estructura análoga a la micotoxina de Alternaría.

2. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Atlernaria preparados en presencia de una plantilla molecular, según la 1O reivindicación 1, donde la micotoxina de Alternaría es alternariol (AOH) y/o alternariol monometil éter (AME) .

3. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Atlernaria preparados en presencia de una plantilla molecular, según reivindicaciones 1 y 2, donde la molécula plantilla se selecciona del grupo: 3-hidroxi-8, 9-dimetoxi-6H-benzo[c]cromen-6-ona (S1-AMEa) 3-hidroxi-8-metoxi-6H-benzo[c]cromen-6-ona (S 1-AMEb) 3-hidroxi-8, 9-dimetoxi-1-metii-6H-benzo[c]cromen-6-ona (S1-AMEc) 3-hidroxi-8-metoxi-1-metii-6H-benzo[c]cromen-6-ona (S1-AMEd)

3, 8, 9-trihdroxi-6H-dibenzo[b, d]piran-6-ona (S1-AOHa) 3, 9-dihdroxi-6H-dibenzo[b, d]piran-6-ona (S1-AOHb) 3, 8, 9-trihidroxi-1-metii-6H-benzo[ c]cromen-6-ona (S1-AOHc) 3, 8-dihidroxi-1-metii-6H-benzo[c]cromen-6-ona (S 1-AOHd) 2, 3, 4-trimetoxibenzoato de 3-metoxifenilo (S2-AMEa)

2, 3, 4-trimetoxibenzoato de 3-metoxi-5-metilfenilo (S2-AMEb) benzoato de 3-metoxifenilo (S2-AMEc) benzoato de 3-metoxi-5-metilfenilo (S2-AMEd) 2, 3, 4-trihidroxibenzoato de 3-hidroxifenilo (S2-A0Ha) 2, 3, 4-trihidroxibenzoato de 3-hidroxi-5-metilfenilo (S2-AOHb)

benzoato de 3-hidroxifenilo (S2-AOHc) benzoato de 3-hidroxi-5-metilfenilo (S2-AOHd)

o cualquiera de sus sales resultantes del tratamiento de la molécula plantilla con uno o más equivalentes de base capaz de reaccionar con grupos hidroxilo fenólicos.

4. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaría preparados en presencia de una plantilla molecular, según reivindicación 3, donde la sal es una sal de amonio cuaternario.

5. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaría preparados en presencia de una plantilla molecular, según reivindicaciones anteriores, preparados con monómeros acrílicos sencillos, monómeros acrílicos di-o tri-funcionales entrecruzantes y/o monómeros acrílicos mono-o poli-funcionales portadores de grupos funcionales químicos que

O muestren afinidad por las moléculas plantilla.

6. Polímeros de impronta molecular, según reivindicación 5, cuyo entrecruzante es etilenglicoldimetacrilato (EDMA) .

7. Polímeros de impronta molecular, según las reivindicación 5 y 6, cuyo (s) monómero (s) funcional ( es) contiene (n) uno o más grupos amino.

8. Polímeros de impronta molecular, según las reivindicaciones 5 y 6, cuyo (s)

monómero (s) funcional ( es) contiene (n) uno o más grupos ácido carboxílico. 20

9. Polímeros de impronta molecular, según las reivindicaciones 5 y 6, cuyo (s) monómero (s) funcional ( es) contiene (n) uno o más grupos derivados . 1 , 3disustituidos de la urea.

1O. Polímeros de impronta molecular, según las reivindicaciones anteriores, preparados en forma de monolito o de bloque.

11. Polímeros de impronta molecular según las reivindicaciones 2-9 que se hayan obtenido a través de cualquier técnica de injerto, recubrimiento de partículas 30

esféricas o nanopartículas.

12. Uso de los polímeros de impronta molecular reivindicados para la preconcentración de AOH, AME o cualquiera de sus derivados en cualquier matriz natural (e.g. carne, pescado, frutas, hortalizas, vegetales o aguas) o en cualquiera de sus derivados (e.g. zumos, vinos) .

13. Uso de de los polímeros de impronta molecular reivindicados para la limpieza de una muestra de AOH, AME o cualquiera de sus derivados en cualquier matriz natural (e.g. carne, pescado, frutas, hortalizas, vegetales o aguas) o en cualquiera de sus derivados (e.g. zumos, vinos) .

14. Uso de de los polímeros de impronta molecular reivindicados como sensor.

15. Uso de de los polímeros de impronta molecular reivindicados como elemento de 10 captura o material de detección en cualquier tipo de ensayo.