Marcadores de daño cerebral.

Un procedimiento para diagnosticar la aparición de daño cerebral en un sujeto,

en el que el procedimientocomprende analizar una muestra que comprende un fluido biológico, o fracción del mismo, de dicho sujeto paradetectar la presencia de un marcador que es el ARNm o el producto proteico del gen localizado en el gen Nº ID 7447(VSNL1) que codifica el tipo visinina 1 (VLP-1), en el que la presencia de dichos marcadores indica daño cerebral.

Marcadores de daño cerebral

Solicitud relacionada La presente solicitud reivindica el beneficio respecto de la solicitud provisional de EE.UU. 60/582.998, presentada el 25 de junio de 2004.

Campo de la técnica La invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar daños cerebrales, tales como ictus o enfermedad de Alzheimer en seres humanos y las correspondientes afecciones en otros animales. Más específicamente, se refiere a procedimientos para identificar marcadores de daños cerebrales y a procedimientos para diagnosticar los daños cerebrales usando dichos marcadores y materiales para su detección.

Técnica anterior

Se ha realizado un esfuerzo considerable para identificar marcadores que serían útiles en la evaluación de los daños cerebrales, tales como los causados por ictus o la enfermedad de Alzheimer. El diagnostico precoz de, por ejemplo, el ictus isquémico, se cree que es crucial para permitir una intervención adecuada, tal como la administración del activador de plasminógeno tisular recombinante, que se ha demostrado que es muy eficaz, si se administra pronto, en la reducción de la mortalidad y la morbididad causadas por el ictus. Además, se desea evaluar otras formas de daño cerebral, tales como ictus hemorrágico, daños en lactantes a término asfixiados, daños cerebrales resultantes de cirugía cardíacas, trastornos neurodegenerativos por Alzheimer o diversos; aunque pueden ser necesarios procedimientos diagnósticos adicionales para distinguir entre estas varias posibilidades en algunos casos.

en general, se reconoce que el daño cerebral de varios tipos puede estar indicado por la presencia en fluidos tales como el líquido cefalorraquídeo (LCR) o, más convenientemente, en suero o plasma u orina, de proteínas u otras sustancias que son generalmente características del cerebro. También se ha reconocido ampliamente la deseabilidad de identificar los factores que puedan usarse para diagnósticos con el fin de identificar el tratamiento adecuado o simplemente para pronóstico. Véase, por ejemplo, Warlow, C., Lancet (2003) 362:1211-1224; Qureshi, A., et al., New Eng J Med, (2001) 344:1450-1460; Marler, J. R., et al., Science (2003) 301:157; Garca-Alix, A., et al., Acta Paediatr (2001) 90:1103-1105; Verbeek, M. M., et al., Ann Clin Biochem.V (2003) 40:25-40.

Por esta comprensión, varios grupos han realizado estudios proteómicos del cerebro para identificar proteínas cerebrales características. Gauss, C., et. al., Electrophoresis (1999) 20:575-600 publicaron un análisis de las proteínas cerebrales en ratones usando electroforesis 2-D y espectrometría de masas. El patrón mostró 8.767 manchas proteicas, 200 de las cuales se identificaron en el artículo. Se han aplicado electroforesis en gel bidimensional y espectroscopia de masas al LCR obtenido seis horas después de la muerte y se comparó con el LCR fresco. Se identificaron trece proteínas candidatas, algunas de las cuales se habían asociado previamente con enfermedades neurodegenerativas (Lescuyer, et al. Proteomics (2004) 4:2234-2241) . Un análisis general de este enfoque se describe en Lubec, G., et al., Progress in Neurobiol (2003) 611:1-19. A news stor y by Abbott, A., in Nature (2003) 425:110 destaca que aunque el análisis de cerebros humanos tiene que realizarse en tejido de autopsia, los cerebros de ratón se pueden analizar a varias edades usando tejido fresco. Asimismo, por ejemplo, Kato, N., et al., Atherosclerosis (2002) 163:279-286, y Rosand, J., et al., Stroke (2003) 34:2512-2517 han realizado intentos de analizar las influencias genómicas sobre el ictus u otras afecciones asociadas con daños cerebrales.

Existe una serie de biomarcadores de lesión cerebral que se han notificado en la literatura científica. Entre estos se incluyen S-100B, enolasa específica de las neuronas (NSE) , proteína asociada fibrilar glial (GFAP) , proteína básica de la mielina (MBP) y otros. (Aurell, A., et al., Stroke (1991) 22:1254-1258; Barone, F. C., et al., Brain Res (1993) 623:77-82; Cunningham, R. T., et al., Eur J Clin Invest (1991) 21:497-500; Hardemark, H. G., et al., J Neurosurg (1989) 71:727-731; Hardemark, H. G., et al., Stroke (1988) 19:1140-1144; Hatfield, R. H., et al., Brain Res (1992) 577:249-252; Hay, E., et al., J Neurol Neurosurg Psychiatr y (1984) 47:724-729; Noppe, M., et al., Clin Chim Acta (1986) 155:143-150; Steinberg, R., et al., J Neurochem (1984) 43:19-24) .

La S-100B es una proteína de unión al Ca2+ que modula las interacciones complejas neuronas-glía y se encuentra principalmente el las células gliales, los melanocitos, las células de Schwann, las células de Langerhans y las células de la hipófisis anterior, pero no en las neuronas. Niveles elevados de S-100B en suero se han asociado con ictus, lesión cerebral posterior a una parada cardíaca y lesión cerebral traumática. (Aurell, A, et al., Stroke (1991) 22:1254-1258; Hardemark, H. G., et al., J Neurosurg (1989) 71:727-731; Noppe, M, et al., Clin Chim Acta (1986) 155:143-150; Bottiger, B. W., et al., Circulation (2001) 103:2694-2698, Sellman, M., et al., Scand J. Thor. Cardiovasc. Surg. (1992) 26:39-45, Shaabam, A., et al., Brit J Anesthesia (2000) 85:287-298) .

Leviton, A., et al., Acta Paediatr (2002) 91:9-13 también estudiaron el uso de S-100B, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y NSE como marcadores de daños cerebrales para el daño cerebral en niños con la vista de su capacidad diagnóstica para evaluar dicha lesión. Rothoerl, R. D., et al., Acta Neurochem (2000) Suppl. 76:97-100 mostraron que los niveles séricos de S-100B también están elevados después de una lesión cerebral grave; Abraha, H. D., et

al., Ann Clin Biochem. (1997) 34:546-550 sugieren que la determinación de la proteína S-100 en suero es un marcador pronóstico útil del desenlace clínico en el ictus agudo. En Mussack, T., et al., Shock (2002) 18:395-400 y en un comentario en este artículo realizado por Vos, P. F. et al., ibid. 481-482 presentaron confirmación adicional de que S-100B y NSE son marcadores significativos de daños cerebrales. Cabe esperar que el incremento de las concentraciones de S-100B, GFAP y NSE en suero se asocien con varios trastornos agudos del sistema nervioso central.

Sin embargo, el S-100B no es específico de cerebro (Vaage, J., et al., J Thorac Cardiovasc Surg (2001) 122:853855; Unden, J., Scand J Infect Dis (2004) 36:10-13) dado que también se expresa en células de tejido adiposo blanco y marrón, piel, músculo esquelético, de melanoma y de glioblastoma (Zimmer, D. B., et al., Brain Res Bull (1995) 37:417-429; Ilg, E. C., et al., Int J Cancer (1996) 68:325-332) , así como en músculo, corazón y riñones (Baudier, J, et al., J Biol Chem (1986) 261:8192-8203; Missler, U., et al., Eur J Clin Chem Clin Biochem (1995) 33:743-748) .

NSE representa el dímero gamma gamma de la proteína enolasa (2-fosfo-D-glicerato hidrolasa) , que es una enzima soluble de la vía glicolítica con un peso molecular total de aproximadamente 80 kDa (Schmechel, D., et al., Science (1978) 199:313-315) . La NSE se expresa en el citoplasma y las dendritas de las neuronas y en las células de sistema de captación y descarboxilación de los precursores de amino (APUD) . Se dispone de estudios clínicos tempranos que demuestran títulos séricos elevados de NSE en pacientes de ictus o de parada cardíaca (Persson, L., et al., Stroke (1987) 18:911-918; Dauberschmidt, R., et al., Mol Chem Neuropathol (1991) 14:237-245; Schaarschmidt, H, et al., Stroke (1994) 25:558-565. Además, las células tumorales en APUDomas, neuroblastomas, seminomas y carcinomas de células pequeñas del pulmón también expresan NSE. Por este motivo, la NSE se ha estudiado como marcador sérico diagnóstico y pronóstico en el tratamiento clínico de dichas neoplasias. No obstante, también se puede encontrar NSE en glóbulos rojos y plaquetas y no se puede considerar específica del cerebro (Johnsson, P. J., Cardiothorac Vasc Anesth (1996) 10:120-126) .

Se han usado combinaciones de marcadores en un intento de obtener mejor sensibilidad y especificidad para el ictus. Un grupo ha usado la combinación de marcadores cerebrales, enolasa específica de neuronas, proteína básica d la mielina y S-100b (Kupchak, P., et al., Clin Chem (2005) 51 (6) : abstracts A119 y A120;) . Otro grupo evaluó >50 biomarcadores proteicos y eligió el S-100B, el factor neurotrófico de tipo B, el factor de Von Willebrand, la matriz metaloproteinasa-9 y la proteína 1 quimiotáctica de monocitos (Reynolds, M., Clin Chem (2003) 45 (10) :1733-1739) . En otro estudio, se combinaron biomarcadores basados en daños cerebrales (S100B) , inflamación (matriz-metaloproteinasa-9 y la molécula de adhesión celular vascular) y trombosis (factor de Von Willebrand) para identificar... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para diagnosticar la aparición de daño cerebral en un sujeto, en el que el procedimiento comprende analizar una muestra que comprende un fluido biológico, o fracción del mismo, de dicho sujeto para detectar la presencia de un marcador que es el ARNm o el producto proteico del gen localizado en el gen Nº ID 7447 (VSNL1) que codifica el tipo visinina 1 (VLP-1) , en el que la presencia de dichos marcadores indica daño cerebral.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el sujeto es humano.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho daño cerebral se debe a un ictus o a la enfermedad de Alzheimer.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que el fluido biológico es LCR, suero, orina o plasma.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el fluido biológico es suero o plasma.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho análisis comprende tratar dicho fluido de muestra con al menos un anticuerpo inmunorreactivo con VLP-1.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la proteína es monoclonal reconoce un epítopo seleccionado de los aminoácidos 3-11, 16-23 .

13. 155 de la VLP-1 humana.

8. El procedimiento de las reivindicaciones 6 o 7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que además incluye analizar dicha muestra para detectar la presencia de un marcador adicional, que es el ARNm o producto proteico de un gen seleccionado del grupo que consiste en el localizado en

el gen Nº ID 6616 (SNAP25) que codifica la proteína asociada con el sinaptosoma, 25 kDa, el gen Nº ID 2571 (GAD1) que codifica la glutamato descarboxilasa 1, (cerebro, 67 kDa) (GAD67) , el gen Nº ID 4336 (MOBP) que codifica la proteína básica de oligodendrocitos asociados con la mielina, el gen Nº ID 6857 (SYT1) que codifica la sinaptotagmina I, el gen Nº ID 10382 (TUBB4) que codifica la tubulina, beta 4, el gen Nº ID 9638 (FEZ1) que codifica la proteína zeta 1 de fasciculación y elongación (Zigina 1) el gen Nº ID 2743 (GLRB) que codifica el receptor de la glicina, beta, el gen Nº ID 140767 (VMP) que codifica la proteína de membrana vesicular p24, el gen Nº ID 10439 (OLFM1) que codifica la olfatomedina 1, el gen Nº ID 7545 (ZIC1) que codifica el miembro 1 de la familia Zic (homólogo mal apareado, Drosophila) , el gen Nº ID 29993 (PACSIN1) que codifica el sustrato de la proteína quinasa C y de la caseína quinasa en

neuronas 1,

el gen Nº ID 5354 (PLP1) que codifica la proteína proteolipídica 1 (enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, paraplejía espástica 2) , el gen Nº ID 9118 (INA) que codifica la proteína del filamento intermedio neuronal internexina, alfa, el gen Nº ID 140679 (SLC32A1) que codifica la familia de transportadores de soluto 32 (transportador vesicular de

GABA) , miembro 1

el gen Nº ID 5274 (SERPINI1) que codifica el inhibidor de la serina (o cisteína) proteinasa, clado I (neuroserpina) , miembro 1 el gen Nº ID 4826 (NNAT) que codifica la neuronatina, el gen Nº ID 2566 (GABRG2) que codifica el receptor A del ácido gamma-aminobutírico (GABA) , gamma 2 el gen Nº ID 6844 (VAMP2) que codifica la proteína de membrana asociada a la vesícula (sinaptobrevina 2) , o el gen Nº ID 4900 (NRGN) que codifica la neurogranina (sustrato de la proteína quinasa C, RC3) .

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el marcador adicional es neuroserpina y los anticuerpos son

inmunorreactivos con un epítopo reconocido por el anticuerpo 4421 2G10.2; y/o 4421 5B5.1; y/o 4421 7D6.3; y/o 4505 2F1.1, o en el que el marcador adicional es zigina y los anticuerpos son inmunorreactivos con un epítopo reconocido por el anticuerpo 4554 1 G4.4; y/o 4563 4G3.1; y/o R4726; y/o R4727, o en el que el marcador adicional es GAD67 y los anticuerpos son inmunorreactivos con un epítopo reconocido por el 5 anticuerpo R4610; y/o R4609; y/o R4043; y/o R4404; y/o Chemicon MAB5406,

o en el que el marcador adicional es internexina y los anticuerpos son inmunorreactivos con un epítopo reconocido por el anticuerpo SC-7571 y/o SC-7570, o en el que el marcador adicional es la proteína asociada con el sinaptosoma 25 kDa y los anticuerpos son inmunorreactivos con un epítopo reconocido por el anticuerpo SC-7538; y/o SC-7539 y/o SC-20038, o en el que el marcador adicional es la proteína proteolipídica 1 y los anticuerpos son inmunorreactivos con un epítopo reconocido por el anticuerpo SC-23570; y/o SC-18529, o en el que el marcador adicional es la proteína básica de oligodendrocitos asociada con la mielina y los anticuerpos son inmunorreactivos con un epítopo reconocido por el anticuerpo SC-14250, y/o SC-25666.