Marcador molecular de potencia terapéutica de células madre mesenquimales humanas y sus usos.

Marcador molecular de potencia terapéutica de células madre mesenquimales humanas y sus usos.

La presente invención se relaciona con métodos para determinar la capacidad inmunorreguladora de una célula madre, basándose en los niveles de expresión del microARN miR-335. Adicionalmente, la invención también se relaciona con métodos in vitro para incrementar la capacidad inmunorreguladora de una célula madre, en donde dichos métodos comprenden tratar dicha célula madre con un inhibidor de miR-335. Finalmente, la invención se relaciona con usos y métodos terapéuticos para tratar a un sujeto con una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, la enfermedad de injerto contra huésped, o una enfermedad que requiera la inducción de tolerancia a un trasplante o la regeneración y/o reparación de tejidos, comprendiendo dichos usos y métodos terapéuticos la administración de una célula madre que presenta niveles reducidos de expresión y/o actividad de miR-335.

MARCADOR MOLECULAR DE POTENCIA TERAPÉUTICA DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES HUMANAS Y SUS USOS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biología molecular y la biomedicina. Específicamente, la presente invención se refiere al uso de miR-335 como marcador molecular para cuantificar la potencia terapéutica de las células madre mesenquimales humanas empleadas en medicina regenerativa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las células madre mesenquimales (MSC) son un tipo de células madre adultas especialmente prometedor por sus aplicaciones terapéuticas. Las células madre mesenquimales humanas (hMSC) se aislaron y caracterizaron por primera vez en el estroma de la médula ósea, constituyendo una población totalmente diferente de las células madre hematopoyéticas, y su papel es contribuir a la regeneración de los tejidos conectivos no hematopoyéticos (hueso, cartílago, músculo, ligamento, tendón, tejido adiposo y estroma) . En la actualidad, si exceptuamos las células madre hematopoyéticas, tradicionalmente empleadas en los trasplantes de médula ósea, son el principal tipo de células empleadas en ensayos clínicos para el tratamiento de patologías muy variadas. Las MSC tienen un gran potencial terapéutico en la regeneración de tejidos, ya que las MSC aisladas y expandidas en cultivo son capaces de diferenciarse a osteoblastos, condrocitos, miocitos y adipocitos, entre otros tipos celulares, y pueden ser reintroducidas posteriormente en el cuerpo humano para reparar tejidos perdidos o dañados. Otra característica si cabe aún más valiosa en la práctica clínica es su capacidad de inmunomodulación, lo que las hace tremendamente útiles para el tratamiento de enfermedades de base inmune. Sin embargo, todavía se conoce muy poco sobre los mecanismos que regulan sus propiedades biológicas y terapéuticas.

Para la gran mayoría de las aplicaciones terapéuticas es necesario contar con un número de hMSC muy superior al que es posible obtener directamente de una biopsia. En consecuencia es necesario realizar procedimientos de expansión ex vivo que permita conseguir las dosis terapéuticas mínimas (10-100 millones) .

Sin embargo, a lo largo de los últimos años, se han ido acumulando evidencias de que dicho proceso de expansión no se realiza en condiciones óptimas y que es recomendable minimizar el tiempo de expansión y reducir la tensión de oxígeno utilizada. El cultivo extenso de hMSC y MSC murinas (mMSC) promueve inestabilidad genética asociada al avance de la senescencia del cultivo. Además, el comportamiento de una biopsia durante la expansión celular es prácticamente impredecible, aunque parece existir una relación significativa con la edad del donante y/o su historial médico.

Recientemente se ha publicado que las hMSC obtenidas de donantes/pacientes con más edad resultan en preparaciones con propiedades terapéuticas reducidas. Los autores proponen que en mMSC la sobreexpresión de PEDF (pigment epithelium-derived factor) que se produce con la edad es un factor crítico que afecta a las propiedades terapéuticas de las células. Otras evidencias marcan alteraciones en diversas rutas. En cuanto a su capacidad osteogénica se ha confirmado que la principal diferencia entre MSC derivadas de donantes jóvenes y viejos es su reducida capacidad de proliferación y su mayor tendencia a la senescencia.

Asimismo, se ha podido confirmar que existen modificaciones epigenéticas en hMSC en genes relevantes asociados tanto con la edad del donante como con el cultivo ex vivo. De forma llamativa se ha podido confirmar que estas deficiencias pueden estar relacionadas con la mala calidad de la matriz extracelular.

Las MSC utilizadas para terapia celular son consideradas medicamentos, por lo que su uso debe atenerse a la Ley del medicamento, ser manipuladas según GMP, etc. Habitualmente una entidad terapéutica que va a ser utilizada como medicamento debe pasar por controles de esterilidad (ej: libre de micoplasma) , identidad (marcadores) , pureza (contaminantes) , y potencia. La liberación de lotes de MSC para su uso en clínica debe ser en menos de 24 horas porque si no las células mueren o se deterioran, por lo que actualmente no se realiza ningún control de potencia porque todos los métodos conocidos tardan semanas por cada lote.

Un problema de los bancos de células para uso clínico es que las MSC presentan una gran variabilidad en su potencial terapéutico. En la actualidad dicho potencial no se puede conocer a priori (son necesarios estudios costosos y dilatados en el tiempo) , por lo cual se pueden llegar a almacenar muchas muestras que realmente sean subóptimas, con el consiguiente gasto y posibles perjuicios para los pacientes.

Existe pues la necesidad de desarrollar un método que permita determinar de forma rápida y eficaz el potencial terapéutico de los lotes de MSC con el fin de determinar su idoneidad para su administración a un paciente.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han descubierto que, sorprendentemente, existe una correlación entre los niveles de expresión del microARN miR-335 y el potencial terapéutico de las células madre mesenquimales humanas (hMSC) . En concreto, existe una correlación entre los niveles de expresión de miR-335 y la capacidad inmunorreguladora de dichas células, de forma que una célula que expresa altos niveles de miR-335 posee una baja capacidad inmunorreguladora, y por tanto un bajo potencial terapéutico. Así, según se observa en la figura 5, hMSC modificadas de forma que sobreexpresan miR-335 poseen una capacidad de inhibición de la proliferación de linfocitos humanos significativamente menor que las células control. Adicionalmente, según se observa en la figura 6, la administración de MSC que sobreexpresan miR-335 a animales resulta en una mortalidad aumentada e respuesta a la administración de LPS con respecto a los ratones que no recibieron células, lo que indica que las MSC han perdido parte de la capacidad de regular la respuesta a LPS. Por tanto, en un primer aspecto la presente invención se relaciona con un método para determinar la capacidad inmunorreguladora de una célula madre, que comprende determinar en dicha célula madre los niveles de expresión y/o actividad de miR-335, en donde niveles elevados con respecto a un valor de referencia son indicativos de que dicha célula madre tiene una baja capacidad inmunorreguladora, o en donde niveles disminuidos respecto a un valor de referencia son indicativos de que dicha célula madre tiene una elevada capacidad inmunorreguladora.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit para determinar la capacidad inmunorreguladora de una célula madre que comprende (i) reactivos adecuados para determinar el nivel de expresión de miR-335 y

(ii) reactivos adecuados para determinar el nivel de expresión y/o de actividad de un marcador de la capacidad inmunorreguladora y/o un marcador de senescencia en dicha célula madre. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para incrementar la capacidad inmunorreguladora de una célula madre, que comprende inhibir en dicha célula madre la expresión y/o actividad de miR-335.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un uso de una célula madre caracterizada porque presenta niveles reducidos de expresión y/o actividad de miR-335 para preparar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo formado por una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, la enfermedad de injerto contra huésped, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 y una enfermedad cardiovascular.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un uso de una célula madre caracterizada porque presenta niveles reducidos de expresión y/o actividad de miR-335 para preparar un medicamento para inducir tolerancia a un trasplante.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un uso de una célula madre caracterizada porque presenta niveles reducidos de expresión y/o actividad de miR-335 para preparar un medicamento para la reparación y regeneración de tejidos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para generar células T reguladoras, que comprende poner en contacto una población de células que contiene células T con una población de células madre caracterizadas porque presentan niveles reducidos de expresión y/o actividad de miR-335 en condiciones adecuadas para la generación de células T reguladoras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Los niveles de expresión de miR-335 en hMSC están directamente relacionados con la edad del donante. Expresión relativa de miR-335 (usando la expresión de RNU6B como control... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar la capacidad inmunorreguladora de una célula madre, que comprende detenninar en dicha célula madre los niveles de expresión y/o actividad de miR-335, en donde niveles elevados con respecto a un valor de referencia son indicativos de que dicha célula madre tiene una baja capacidad inmunorreguladora, o en donde niveles disminuidos respecto a un valor de referencia son indicativos de que dicha célula madre tiene una elevada capacidad inmunorreguladora, en donde dicha célula madre no se obtiene mediante métodos que destruyan embriones humanos o utilicen embriones humanos como materia prima.

2. Método según la reivindicación 1, en donde la célula madre es una célula madre adulta.

3. Método según las reivindicaciones 1 y 2, en donde la célula madre es una célula madre adulta mesenquimal.

4. Método según la reivindicación 3, en donde la célula madre adulta mesenquimal procede de médula ósea o de tejido adiposo subcutáneo.

5. Un kit para detenninar la capacidad inmunorreguladora de una célula madre que comprende

(i) reactivos adecuados para detenninar el nivel de expresión de miR-335, en donde dichos reactivos son una o más parejas de oligonucleótidos diseñados específicamente para amplíficar miR-335 mediante RT-PCRy

(ii) reactivos adecuados para detenninar el nivel de expresión y de al menos un marcador adicional de la capacidad inmunorreguladora, en donde dichos reactivos son una o más parejas de oligonucleótidos diseñados específicamente para amplíficar dicho marcador de la capacidad inmunorreguladora mediante RT-PCR yen donde dicho marcador de la capacidad inmunorreguladora se selecciona del grupo fonnado por MHC de clase 1, MHC de clase II, CD40, CD80, CD86, B7-DC (PD-L2) , B7Hl (PD-Ll) , B7H2 (CD275/ICOSL) , B7H3 (CD276) , B7H4 (VTCN1) , B7H5, B7H6, B7H7, y/o reactivos adecuados para detenninar el nivel de actividad de un marcador de senescencia en dicha célula madre, en donde dicho marcador de senescencia es beta-galactosidasa y dichos reactivos son uno o más sustratos artificiales de beta-galactosidasa,

en donde dicha célula madre no se obtiene mediante métodos que destruyan embriones humanos o utilicen embriones humanos como materia prima.

6. Un kit según reivindicación 5 en donde el sustrato artificial de beta-galactosidasa se selecciona del grupo fonnado por nitro-fenil-B-Dgalactopiranósido (ONPG) , clorofenil rojo B-D-galactopiranósido (CPRG) , bromocloroindolil B-D-galactopiranósido (X-gal) , fluoresceín di-B-D-galactopiranósido (FDG) y el sustrato galactón.

7. Un método in vitro para incrementar la capacidad iumunorreguladora de una célula madre, que comprende inhibir en dicha célula madre la expresión y/o actividad de miR-335, en donde dicha célula madre no se obtiene mediante métodos que destruyan embriones humanos o utilicen embriones humanos como materia prima.

8. Método según la reivindicación 7, en donde dicha célula madre es una célula madre adulta.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 ó 8, en donde dicha célula madre es una célula madre mesenquimal.

10. Método según la reivindicación 9, en donde dicha célula madre adulta mesenquimal procede de médula ósea o de tejido adiposo subcutáneo.

11. Uso de una célula madre caracterizada porque presenta niveles reducidos de expresión y/o actividad de miR335 para preparar un medicamento para el tratamiento de una enfennedad seleccionada del grupo fonnado por una enfennedad auto inmune , una enfennedad inflamatoria, la enfennedad de injerto contra huésped, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 y una enfennedad cardiovascular, en donde dicha célula madre no se obtiene mediante métodos que destruyan embriones hnmanos o utilicen embriones humanos como materia prima.

12. Uso de una célula madre caracterizada porque presenta niveles reducidos de expresión y/o actividad de miR335 para preparar un medicamento para inducir tolerancia a un trasplante, en donde dicha célula madre no se obtiene mediante métodos que destruyan embriones humanos o utilicen embriones humanos como materia prima.

13. Uso de una célula madre caracterizada porque presenta niveles reducidos de expresión y/o actividad de miR335 para preparar un medicamento para la reparación y regeneración de tejidos, en donde dicha célula madre no se obtiene mediante métodos que destruyan embriones humanos o utilicen embriones humanos como materia prima.

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en donde dicha célula madre se encuentra modificada mediante un inhibidor de miR-335.

15. Uso según la reivindicación 14, en donde el inhibidor de miR-335 es un polinucleótido de cadena sencilla que hibrida específicamente con miR-335 impidiendo su función.

16. Uso según la reivindicación 15, en donde el polinucleótido de cadena sencilla que hibrida específicamente con miR-335 impidiendo su función contiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, o una secuencia claramente relacionada.

17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en donde la célula madre es una célula madre adulta.

18. Uso según la reivindicación 17, en donde la célula madre es una célula madre adulta mesenquimal.

19. Uso según la reivindicación 18, en donde la célula madre adulta mesenquimal procede de médula ósea o de tejido adiposo subcutáneo.

20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en donde la célula madre es autóloga, alogénica o xenogénica con respecto al sujeto a ser tratado.

21. Un método in vitro para generar células T reguladoras, que comprende poner en contacto una población de células que contiene células T con una población de células madre caracterizadas porque presentan niveles reducidos de expresión y/o actividad de miR-335 en condiciones adecnadas para la generación de células T reguladoras, en donde dichas células madre no se obtienen mediante métodos que destruyan embriones hnmanos o utilicen embriones humanos como materia prima y en donde dichas condiciones adecuadas

comprenden co-cultivar dicha población de células madre con dicha población de células que contiene células T durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 5 días, en donde la proporción de células madre y células T en el co-cultivo está comprendida entre 1:2 y 1 :20000.

22. Método in vitro según la reivindicación 21, en donde la población que contiene células T es una población de células mono nucleares de sangre periférica (PBMC) .

23. Método in vitro según las reivindicaciones 21 y 22, en donde la población de células madre es una población de células madre adultas.

24. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde la población de células madre es una población de células madre mesenquimales.

25. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en donde la población de células madre es 15 autóloga o alogénica respecto a la población que contiene células T.

A

B

FIG. 1

Expresión relativa de miR-355 Expresión relativa de miR-355

FIG. 2

Días

Días FIG. 3

% Incorporación de BrdU

Expresión relativa de miR-355

FIG. 4

FIG. 5

Tiempo (h)

FIG. 6