PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE EXTRACTO DE HIDROXITIROSOL, EXTRACTO MEZCLA DE HIDROXITIROSOL Y 3,4-DIHIDROXIFENILGLICOL, Y EXTRACTO DE ACETATO DE HIDROXITIROSILO, A PARTIR DE SUBPRODUCTOS DEL OLIVO Y SU PURIFICACIÓN.

Procedimiento para la obtención de extracto de hidroxitirosol,

extracto mezcla de hidroxitirosol y 3,4-dihidroxifenilglicol, y extracto de acetato de hidroxitirosilo, a partir de subproductos del olivo, y su purificación.

Procedimiento para la obtención de un extracto que comprende hidroxitirosol, bien como producto acetilado o como mezcla con 3,4 dihidroxifenilglicol y la purificación de todos ellos, que comprende al menos una cromatografía en columna de una fuente de hidroxitirosol como subproductos de la aceituna y del olivar, utilizando una mezcla de al menos dos resinas iónicas, preferentemente una resina aniónica con una resina catiónica. Preferentemente en una primera fase se obtiene una fuente líquida rica en fenoles como materia prima para la extracción y purificación de compuestos fenólicos, una segunda fase permite obtener un extracto enriquecido en hidroxitirosol (HT), una mezcla hidroxitirosol con 3-4-dihidroxifenilglicol (DHFG) y se produce acetato de hidroxitirosilo, obteniendo en la tercera fase hidroxitirosol muy puro, el DHFG, su mezcla, y acetato de HT. Cada fase comprende extracción, reacción, concentración, adsorción y desorción, utilizando mezclas de resinas de intercambio iónico, adsorción en resinas no iónicas y una fracción fenólica polimérica, membranas de ósmosis inversa y/o evaporadores.

Procedimiento para la obtención de extracto de hidroxitirosol, extracto mezcla de hidroxitirosol y 3, 4-dihidroxifenilglicol, y extracto de acetato de hidroxitirosilo, a partir de subproductos del olivo, y su purificación

SECTOR DE LA TÉCNICA

La técnica objeto de la presente patente está dirigida a un amplio sector industrial que abarca no sólo al agrícola sino también al cosmético, al de la alimentación, al nutracéutico y al farmacológico. En general su uso estará condicionado por las propiedades que derivan en gran medida del potencial como antioxidante natural del hidroxitirosol (HT) , su acetato y su mezcla con el 3, 4-dihidroxifenilglicol (DHFG) y a su alta actividad biológica para la prevención dentro de la formulación de alimentos funcionales o fármacos de enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas, cáncer u otras relacionadas con su actividad antiinflamatoria, antimicrobiana, etc.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Estudios epidemiológicos indican que la dieta Mediterránea está asociada a una menor incidencia de enfermedades cardiovasculares, ateroesclerosis y ciertos tipos de cánceres (piel, pecho, próstata y colon) (López-Miranda y col., 2010) . Se trata de una dieta rica en frutas y vegetales frescos, con una relativa baja proporción de grasa animal y teniendo al aceite de oliva como principal fuente de grasa. Estos efectos beneficiosos se los han atribuido no solo a una baja proporción ácidos grasos saturados/monoinsaturados del aceite de oliva, sino también a otras moléculas adicionales presentes en menor concentración, en particular a los compuestos fenólicos antioxidantes.

El interés en los antioxidantes naturales se está incrementando hoy en día porque crecen las evidencias que indican que son capaces de contrarrestar los efectos geno y citotóxicos de los radicales libres y especies reactivas de oxígeno, que se producen en casos de stress oxidativo y, que están implicadas en varios procesos patológicos, tales como enfermedades renales y hepáticas, en procesos inflamatorios y en cáncer (Menéndez y col., 2008) . Es por eso que a partir de la aceituna se aíslan varios de ellos destacando entre todos el hidroxitirosol (3, 4-dihidroxifeniletanol) .

Según la “European Olive Oil Medical Information Librar y ”, el hidroxitirosol (HT) es un compuesto fenólico de una reconocida especial eficacia antioxidante. Sus propiedades antioxidantes se atribuyen especialmente a la presencia de dos grupos hidroxilo en posición orto, es decir un grupo ortodifenol, característico de los biofenoles. Además de su capacidad de donar electrones y de neutralizar radicales libres, su elevada eficacia antioxidante radica en su capacidad de secuestro o quelación de iones metálicos de Fe o Cu, entre otros, responsables de la formación de radicales libres durante procesos redox.

En los últimos años, se ha comprobado que este antioxidante natural HT posee además importantes propiedades biológicas. Hay evidencias que sugieren su potencial neuroprotector, protegiendo células cerebrales de ratones. También presenta un rango de funciones que están relacionada con la protección cardiovascular tales como estimulación del sistema de defensa de detoxificación y transcripción antioxidante, alteración de la expresión de genes relacionados con el desarrollo y progresión de la ateroesclerosis y/o la protección cardiovascular, mejora del perfil lipídico, incremento de efectos antitrombóticos y descenso de marcadores antiinflamatorios (ciclooxigenasa-2, tromboxeno, proteínas reactiva C, etc) . Además se ha demostrado la capacidad de estos compuestos de permanecer enlazados a las proteínas LDL protegiéndolas frente a la oxidación. También se ha demostrado que el HT induce un amplio rango de efectos antitumorales incluyendo supresión de proliferación e inducción de apoptosis en células de carcinoma de colon.

Actualmente, son, por tanto, numerosas las investigaciones que intentan demostrar la actuación de este compuesto en la prevención y tratamiento de gran número de enfermedades. Previene contra la degeneración macular y mejora de la visión, el ictus cerebral isquémico y el envejecimiento de la piel. Todos estos antecedentes sugieren además el uso del HT como componente funcional en alimentos, así como su empleo para la prevención del deterioro de los mismos debido a su demostrada capacidad para inhibir la oxidación de los lípidos insaturados.

Se han desarrollado y patentado diversos métodos y sistemas encaminados a la obtención de extractos ricos en HT y aquellos que tratan de aislar y purificar el componente HT desde la aceituna y sus subproductos, así como desde la hoja de olivo.

En muchos casos se utilizan técnicas de extracción con disolvente o procedimientos de separación y concentración selectiva por ultrafiltración, osmosis inversa, evaporación, separación cromatográfica y extracción con fluidos supercríticos, a partir tanto de las aguas de vegetación separadas del alperujo, como de las aguas de procesado de la aceituna de mesa. Estas técnicas pueden ser usadas individualmente o de modo integrado. Así después de efectuar una ultrafiltración de las aguas generadas en el procesado de la aceituna de mesa se procedía a efectuar un proceso de adsorción en resina no iónica (tipo XAD) para obtener un extracto rico en hidroxitirosol (ES 2.186.467) . También se han descrito técnicas de separación por membrana de microfiltración, ultrafiltración, nanofiltración y ósmosis inversa, seguido de un proceso de purificación en columna (US 2006/0070953) .

Por otro lado también se obtienen extractos de hidroxitirosol a partir de las aguas de vegetación de la aceituna mediante fluidos supercríticos, tal como el dióxido de carbono (US 2002/0198415) .

Uno de los procedimientos más simple, práctico y económico de los descritos es el que permite obtener un hidroxitirosol con alto grado de pureza a partir de cualquier fuente acuosa (alpechín, fase acuosa del proceso hidrotérmico del alperujo, agua de lavado de la elaboración de las aceitunas de mesa, etc.) mediante una cromatografía en dos pasos, una primera con una resina de intercambio iónico y una segunda con una resina adsorbente del tipo XAD (US 2004/0102657) .

También se ha descrito la extracción del HT a partir del alpechín mediante una mezcla de acetato de etilo y etanol o acetato de etilo, etanol y agua para posteriormente llevar a cabo tratamientos de la fase orgánica con una resina del tipo XAD, que permite obtener unos extractos con una alta concentración de HT (ES 2311401) .

De los métodos de síntesis que existen, el descrito por Capaso et al. (Capasso, R., Evidente, A., Avolio, S. Y Solla, F. 1999. J. Agric. Food Chem. 47: 1745-1748) , es según el propio autor el más conveniente respecto a los otros descritos en la literatura (Baraldi, P. G., Simoni, D., Manfredini, S. Y Menziani, E. 1983. Liebigs Ann. Chem. 684-689) . El hidroxitirosol se sintetiza a partir del ácido 3, 4-dihidroxifenilacético por reducción con LiAlH4 en tetrahidrofurano, bajo reflujo, durante 2 horas.

Bai et al. (Bai, C., Yan, X., Takenaka, M., Sekiya, K. Y Nagata, T. 1998. J. Agric. Food Chem. 46: 3998-4001) , también lo sintetizaron con alto rendimiento, a escala de gramos, y con alta pureza. La síntesis se realiza a partir del mismo ácido, 3, 4 dihidroxifenilacético, pero utilizando un sistema de metilación con trimetilsildiazometano y posterior reducción del éster obtenido con NaBH4. Más recientemente se obtiene por reducción del metiléster del ácido fenilacético con borohidruro sódico (WO2007/009590) o por oxidación de tirosol en presencia de peróxido de hidrógeno y trióxido de metilrenio (US2009/0023815) .

Por via enzimática, se obtiene a partir del tirosol usando como catalizador una tirosinasa de hongo (ES2170006) .

Además del HT, también su derivado monoacetilado, acetato de hidroxitirosilo es un compuesto natural que ha sido detectado en el aceite de oliva virgen. Se trata de un compuesto que es bastante lipófilo con un efecto antioxidante similar al HT con lo que tendría mucha aplicación como aditivo funcional en alimentos grasos. Se ha descrito un procedimiento de obtención de monoésteres de hidroxitirosilo a partir del HT mediante una reacción regioselectiva de esterificación sobre el hidroxilo alifático (ES1541544) . Se ha demostrado que este compuesto ejerce un efecto antiagregante plaquetario en humanos superior al HT y similar al efecto ejercido por el ácido acetilsalicílico (González Correa et al., 2009) . También se ha descrito un proceso para producir triacetilhidroxitirosol mediante una mezcla acilante de ácido perclórico y anhidro acético que lo vuelve químicamente más estable que el HT y... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la obtención secuencial de extractos con elevada concentración en hidroxitirosol, en una mezcla de hidroxitirosol y 3, 4-dihidroxifenilglicol y en acetato de hidroxitirosilo, caracterizado porque dicho procedimiento comprende la realización de al menos una cromatografía en columna de una fuente de hidroxitirosol, utilizando una mezcla de al menos dos resinas iónicas, preferentemente una resina aniónica con una resina catiónica.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de hidroxitirosol es sólida o semisólida y se realiza una etapa a) previa que comprende la realización de una extracción en fase líquida y separación de la fase líquida mediante filtración, centrifugación, decantación o una combinación de centrifugación y decantación.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de hidroxitirosol es líquida y se realiza una etapa a) previa que comprende la realización de una hidrólisis.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de hidroxitirosol está seleccionada entre alpechín, orujo, alperujo, hojas, poda, hueso, aguas de proceso de aderezo, plantas de la familia de oleáceas y combinaciones de las mismas.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla de resina aniónica y catiónica comprende al menos 2% en peso del total de la mezcla en resina catiónica.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se lleva a cabo una activación parcial de la mezcla de resinas que se realiza a temperatura ambiente con una solución seleccionada entre una solución ácida, una solución básica y una disolución salina, o bien con una solución seleccionada entre una solución ácida, una solución básica y una disolución salina, y calentando a temperaturas de al menos 50ºC durante la regeneración.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque para realizar la cromatografía la fuente de hidroxitirosol se hace pasar por la columna y se vacía dicha fuente antes de pasar un eluyente.

8. Procedimiento según la reivindicación 1 o la 7, caracterizado porque para la realización de la cromatografía en columna la fuente de hidroxitirosol se carga en el lugar donde se genera la misma fuente a través de columnas móviles

o en planta.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende posterior a la elución de la columna, una etapa de acetilación de hidroxitirosol.

10. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 9, caracterizado porque la cromatografía en columna comprende una descarga secuencial de dicha columna con agua neutra o acidificada en una primera serie de eluciones en un primer paso de descarga, y con agua neutra o acidificada en una segunda serie de eluciones en un segundo paso de descarga.

11. Procedimiento según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque en la realización de la cromatografía en columna con mezcla de resinas iónicas la descarga secuencial de la columna comprende en un tercer paso:

- el vaciado de la columna,

- una posterior inundación de la columna por completo con acetato de etilo cerrando la entrada y salida de la columna y calentando,

- y nuevo vaciado de la columna.

12. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 10, caracterizado porque se realiza una acetilación que comprende:

-realizar la cromatografía en columna obteniendo extracto de hidroxitirosol o el hidroxitirosol ya purificado, poner en contacto una resina catiónica con dicho extracto de hidroxitirosol o el hidroxitirosol purificado, y llevar a cabo la reacción de acetilación en tanque agitado aplicado una temperatura superior a 50ºC en presencia de acetato de etilo.

13. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además una etapa de purificación del extracto obtenido que comprende realizar una o varias de las siguientes operaciones:

- realizar una cromatografía de adsorción con resinas no iónicas y posterior desorción,

- una purificación por adsorción sobre una fracción fenólica polimérica reteniendo dicha fracción el hidroxitirosol

o el extracto formado por hidroxitirosol y por 3, 4-dihidroxifenilglicol, y redisolución de dicho hidroxitirosol y 3, 4dihidroxifenilglicol de forma conjunta o individual,

- concentración del extracto o de los compuestos purificados mediante evaporación, atomización o concentración por ósmosis inversa obteniéndose un producto seco o parcialmente hidratado.

14. Un producto seleccionado entre los compuestos hidroxitirosol, acetato de hidroxitirosilo y 3, 4-dihidroxifenilglicol, y

combinaciones de dichos compuestos, caracterizado porque es obtenible a través del procedimiento descrito en una de 5 las reivindicaciones 1 a 21.

15. Un producto que es una mezcla de hidroxitirosol y 3, 4-dihidroxifenilglicol en una relación mínima de 10:1 y máxima de 1:2.

16. Un producto según la reivindicación 14 caracterizado porque está seleccionado entre:

- hidroxitirosol con una pureza entr.

8. 100%.

10. una mezcla de hidroxitirosol y 3, 4-dihidroxifenilglicol con una pureza entr.

6. 100% como suma de las individuales,

-3, 4-dihidroxifenilglicol con una pureza entr.

5. 100%, y

-acetato de hidroxitirosol con una pureza entr.

8. 100%.

17. Un extracto fenólico caracterizado porque comprende el producto definido en una de las reivindicaciones 14 a 16.

18. Un extracto fenólico caracterizado porque es obtenible mediante el procedimiento descrito en una de las 15 reivindicaciones 1 a 13.

19. Uso del extracto definido en una de las reivindicaciones 17 a 18 o del producto definido en una de las reivindicaciones 14 a 16, como agente antioxidante, antiinflamatorio, antimicrobiano, antidegenerativo celular, anticanceroso y secuestrante de radicales libres en formulaciones de alimentos, productos cosméticos y fármacos.

20. Uso del extracto definido en una de las reivindicaciones 17 a 18 o del producto definido en una de las

reivindicaciones 14 a 16, como agente formando parte de en emulsiones, nano y microencapsulaciones o adsorbidos en otras sustancias para mejorar sus propiedades físico-químicas y/o estabilidad.

21. Uso combinado del hidroxitirosol y DHFG, o de HT y acetato de hidroxitirosilo en mezclas de medios hidrófilos y lipófilos que estén o no formando emulsiones en una formulación seleccionada entre formulación de alimentos, de productos cosméticos y de fármacos.