Procedimiento para la identificación de compuestos novedosos que interaccionan con enzimas.

Un procedimiento de caracterización de al menos una enzima, que comprende las etapas de:

a) proporcionar dos alícuotas que comprende cada una al menos una célula que contiene la enzima,

b) incubar una alícuota con un compuesto dado diferente de los ligandos,

c) recoger las células,

d) lisar las células,

e) poner en contacto los lisados celulares en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos dosligandos de enzimas de amplio espectro diferentes, en los que los ligandos están inmovilizados en un soporte sólido encondiciones que permiten la unión del enzima a dichos ligandos enzimáticos de amplio espectro,

f) eluir la enzima o las enzimas, y

g) caracterizar la enzima eluida o las enzimas eluidas por espectrometría de masas cuantitativa.

Procedimiento para la identificación de compuestos novedosos que interaccionan con enzimas La presente invención se refiere a procedimientos para la caracterización de enzimas usando ligandos de enzimas unidos a soportes sólidos.

La meta del descubrimiento de fármacos es desarrollar medicinas efectivas y seguras. Con el fin de lograr esta meta, la investigación farmacéutica tiene como objetivo identificar preferentemente fármacos de moléculas pequeñas dirigidos a dianas de fármacos que se sabe que son causantes de la enfermedad de interés.

Tradicionalmente, la mayoría de los fármacos de moléculas pequeñas están dirigidos contra proteínas receptoras (receptores de membrana celular tales como receptores acoplados a proteínas G (GPCR) o receptores de hormonas nucleares) , canales iónicos y enzimas. De los enzimas, son de interés particular por ejemplo proteasas, fosfodiesterasas y cinasas (revisión: Drews, 2000, "Drug discover y : a historical perspective", Science 287, 1960-1964) .

Las proteasas se consideran como dianas de fármacos tratables como se demuestra por la gestión efectiva de SIDA con inhibidores de proteasas del VIH o por el uso de inhibidores de enzima conversora de angiotensina para tratar hipertensión. Para el tratamiento de cáncer están en desarrollo inhibidores de proteasas dirigidas contra metaloproteinasas de matriz y caspasas (Docherty y cols., 2003, "Proteases as drug targets", Biochemical Society Symposia 70, 147-161) .

Las fosfodiesterasas (PDE) comprenden una familia de enzimas que catalizan la hidrólisis de AMPc o GMPc y están implicadas en diversas enfermedades. El inhibidor de PDE5 sildenafil (Viagra) proporciona un tratamiento efectivo para la disfunción eréctil. Actualmente los inhibidores de PDE4 (por ejemplo cilomast y roflumast) están en pruebas clínicas como productos terapéuticos anti-inflamatorios. Un desafío mayor en este campo es el desarrollo de inhibidores específicos de isotipo PDE con el fin de evitar reactividad cruzada que es responsable de efectos secundarios (Card y cols., 2004, "Structural basis for the activity of drugs that inhibit phosphodiesterases", Structure 12, 2233-2247) .

Las cinasas catalizan la fosforilación de proteínas, lípidos, azúcares, nucleósidos y otros metabolitos celulares y desempeñan papeles clave en todos los aspectos de la fisiología de células eucariotas.

La fosforilación de proteínas es una modificación postraduccional común de proteínas y afecta la estructura de proteínas y funciona de numerosas maneras.

Una clase de cinasas que ha llegado a ser un foco reciente de descubrimiento de fármacos comprende las proteína cinasas debido a que estarán mostrando jugar papeles importantes en la iniciación y progresión de tumores por desregulación de rutas de transducción de señales en cáncer de pulmón; sobreexpresión del receptor de ErbB2/Her-2 en cáncer de mama; proteínas de fusión BCR-ABL en leucemia; revisión: Blume-Jensen y Hunter, 2001, "Oncogenic kinase signaling", Nature 411, 355-365) .

El complemento de proteína cinasas codificadas en el genoma humano comprende 518 miembros de familia (quinoma) que pueden agruparse en varias subfamilias de acuerdo con la similitud de secuencias (revisión: Manning y cols., 2002, The Protein Kinase Complement of the Human Genome, Science 298, 1912-1934) . En cualquier célula o tejido dado solo se expresa un subgrupo de quinoma. Las cinasas transfieren grupos fosfato desde ATP hasta moléculas sustrato e influencian por lo tanto la estabilidad, la actividad y la función de sus dianas. El bolsillo de unión a ATP de diferentes cinasas es estructuralmente similar y por lo tanto se considera difícil desarrollar inhibidores competitivos de ATP selectivos.

La familia de cinasas es una familia de enzimas muy grande (comparada con otras clases de enzimas relevantes como objetivos de fármacos, por ejemplo fosfodiesterasas) proporcionando múltiples oportunidades para descubrimiento de fármacos pero también retos únicos (familia de gran tamaño; similitud estructural de los bolsillos de unión a ATP, concentración de ATP intracelular alta) (revisión: Cohen, P., 2002, Protein kinases -the major drug targets of the twenty-first centur y ? Nature Reviews Drug Discover y , volumen 1, 309-315) .

Otra clase de cinasas de interés son las cinasas de lípidos. Las cinasas de lípidos catalizan la transferencia de grupos gamma-fosfatos a partir de nucleósido trifosfatos a sustratos lipídicos.

Se sabe que las cinasas de lípidos tales como los miembros de la familia de las fosfoinosítidos 3-cinasas (PI3K) son moduladores de la respuesta celular a factores de crecimiento, hormonas y neurotransmisores y están implicados en cáncer, diabetes y otras enfermedades (Fruman y cols., 1998. Phosphoinositide kinases. Annual Review Biochemistr y 67, 481-507; Cantley, L.C., 2002, Science 296, 1655-1657) .

Un prerrequisto para la identificación de compuestos que interaccionan con proteínas, por ejemplo enzimas, es la provisión de preparaciones de proteínas que contienen tantas proteínas como sea posible de una clase en una gran pureza. Especialmente, la provisión de muchas proteínas de una clase (por ejemplo cinasas) es importante dado que esto permite el rastreo de compuestos potencialmente interesantes farmacéuticamente contra muchos miembros de la

familia de las proteínas (así llamado identificación por acierto) . Otros usos factibles de tales preparaciones de proteínas incluyen la realización de pruebas de compuestos químicamente optimizados (optimización de compuestos) , la determinación de la selectividad de un compuesto dado (revelación del perfil completo de selectividad) así como la confirmación del modo de acción de un compuesto dado.

En la técnica, se han propuesto varias estrategias para valorar este tema.

Una aproximación para enriquecer las proteínas de unión a ATP tales como cinasas y otras proteínas de unión a nucleótidos a partir de extractos celulares se basa en ATP inmovilizado como reactivo de afinidad, es decir en el uso de un ligando que une potencialmente todas las enzimas de unión a ATP. En este caso el ATP está inmovilizado covalentemente acoplando el grupo gamma-fosfato por un engarce a una resina (Graves y cols., 2002, Molecular Pharmacology 62, N.º: 6, 1364-1372; documento US 5536822) . Este enfoque se amplió adicionalmente para acoplar compuestos simples de bibliotecas de compuestos combinatorias (documento WO00/63694) .

Una desventaja del ATP inmovilizado es que la afinidad por cinasas es más bien baja conduciendo a captura de cinasas ineficaz o a elución rápida debido a velocidades de disociación altas. Otra desventaja es que las cinasas no se capturan preferencialmente, sino que también se capturan otras clases de proteínas de unión a ATP que pueden expresarse a niveles mucho más altos en la célula. Las proteínas de unión a ATP más abundantes pueden causar captura ineficaz debido a competición o pueden conducir a problemas durante el análisis por espectrometría de masas de las proteínas unidas si la profundidad analítica no es suficiente.

Otro enfoque descrito en la técnica es el uso de ligandos específicos para una enzima individual, a saber inhibidores de cinasas de afinidad alta e inhibidores de cinasas altamente selectivos o derivados cercanos (por ejemplo fármacos optimizados) . Estos se usan para enriquecer cinasas a partir de lisados celulares y el mismo compuesto no modificado se usa para elución específica con el fin de identificar el objetivo u objetivos de fármacos celulares (Godl y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 15434-15439; documento WO 2004/013633) . Esta aproximación es solamente exitosa si la relación estructura-función (SAR) no se destruye por la modificación química del fármaco pero falla si la SAR se altera. Además, es difícil identificar objetivos que median efectos secundarios indeseados debido a que la SAR de la diana de fármaco relacionado puede ser diferente y la última SAR usualmente no se conoce.

El rastreo intensivo de una biblioteca de química combinatoria de purinas 2, 6, 9-trisustituidas ha conducido a la identificación de un inhibidor de CDK potente y selectivo llamado purvalanol (Knockaert y cols., 2002, Oncogene, vol. 21, 6413-6424) . Aquí, los extractos celulares se rastrearon en busca de proteínas que interactuasen con purlavanol por cromatografía de afinidad en presencia de compuestos inmovilizados.

Se describe adicionalmente en la técnica la identificación de proteínas objetivo novedosas de la ruta de señalización de GMP cíclica llevando a cabo ensayos de unión de competición en lisados de tejido en los que el ligando GMPc inmovilizado está incubado con extractos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de caracterización de al menos una enzima, que comprende las etapas de: a) proporcionar dos alícuotas que comprende cada una al menos una célula que contiene la enzima, b) incubar una alícuota con un compuesto dado diferente de los ligandos, c) recoger las células, d) lisar las células, e) poner en contacto los lisados celulares en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos dos

ligandos de enzimas de amplio espectro diferentes, en los que los ligandos están inmovilizados en un soporte sólido en condiciones que permiten la unión del enzima a dichos ligandos enzimáticos de amplio espectro, f) eluir la enzima o las enzimas, y g) caracterizar la enzima eluida o las enzimas eluidas por espectrometría de masas cuantitativa.

2. Un procedimiento de caracterización de al menos una enzima, comprendiendo las etapas de:

a) proporcionar dos alícuotas de una preparación proteica que contiene la enzima,

b) poner en contacto una alícuota en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos dos ligandos de enzimas de amplio espectro diferentes, en los que los ligandos están inmovilizados en soporte sólido en condiciones que permitan la unión del enzima a dichos ligandos enzimáticos de amplio espectro,

c) poner en contacto la otra alícuota en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos dos ligandos enzimáticos de amplio espectro diferentes, en los que los ligandos están inmovilizados en un soporte sólido en condiciones que permiten la unión del enzima a dichos ligandos enzimáticos de amplio espectro y con un compuesto dado diferente de los ligandos,

d) eluir la enzima o las enzimas y

e) caracterizar la enzima eluida o las enzimas eluidas por espectrometría de masas cuantitativa,

en el que una detección reducida de la enzima en la alícuota incubada con el compuesto indica que la enzima es una diana directa del compuesto.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la provisión de una preparación proteica en la etapa a) incluye las etapas de recoger al menos una célula que contenga el enzima y lisar la célula.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, llevadas a cabo como un rastreo de alto rendimiento.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho compuesto está seleccionado del grupo que consiste en compuestos sintéticos, o fármacos sintéticos orgánicos, más preferentemente fármacos orgánicos de moléculas pequeñas y compuestos de moléculas pequeñas naturales.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la enzima está seleccionada del grupo que consiste en una cinasa, una fosfatasa, una proteasa, una fosfodiesterasa, una hidrogenasa, una deshidrogenasa, una ligasa, una isomerasa, una transferasa, una acetilasa, una deacetilasa, una GTPasa, una polimerasa, una nucleasa y una helicasa.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ligando une al 10 % al 50 %, preferentemente 30 % al 50 % de las enzimas de una clase dada de enzimas.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando es un inhibidor.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la enzima es una cinasa y el ligando está seleccionado del grupo que consiste en bisindolilmaleimida VIII, Purvalanol B, CZC00007324 (PD173955 enlazable) y CZC00008004.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la caracterización del enzima se lleva a cabo caracterizando compañeros de unión co-eluidos de la enzima, subunidades de la enzima o modificaciones postraduccionales de la enzima.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la caracterización se lleva a cabo por identificación de péptidos proteotípicos de la enzima o del compañero de unión de la enzima.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la caracterización se lleva a cabo comparando los péptidos

proteotípicos obtenidos para la enzima y el compañero de unión con péptidos proteotípicos conocidos.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el soporte solido está seleccionado del grupo que consiste en agarosa, agarosa modificada, perlas de sefarosa (por ejemplo sefarosa activada con NHS) , látex, celulosa y partículas ferromagnéticas o ferrimagnéticas.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que los ligandos de enzimas de amplio espectro están acoplados covalentemente al soporte sólido.

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que se usan 2 a 10 ligandos diferentes, preferentemente 2 a 6, más preferentemente 2 a 4.

16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que mediante lacaracterización de la enzima o

el complejo-enzima-compuesto se determina la identidad de todos o de partes de los miembros de una clase enzimática en una célula.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la unión entre ligandos y enzima es una unión no covalente.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ligando de amplio espectro es 15 capaz de unir algunas de, pero no todas, las enzimas presentes en la preparación de proteínas.

Figura 1: Figura 2: Figura 3: Figura 4: Figura 5 (1/2) : Figura 5 (2/2) :