OBTENCIÓN DEL PERFIL DE SELECTIVIDAD DE MOLÉCULAS DE INTERACIÓN CON PI3K CONTRA DIANAS MÚLTIPLES.

Método para la identificación de un compuesto de interacción con PI3K,

que comprende las etapas de

a) proporcionar una preparación de proteínas que contiene PI3K,

b) poner en contacto la preparación de proteínas con 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida o sal de la misma inmovilizada sobre un soporte sólido en condiciones que permiten la formación de un complejo de 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro- 3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida - PI3K,

c) incubar el complejo de 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metiltiazol-2il]-propionamida

- PI3K con un compuesto dado,

d) determinar si el compuesto puede separar PI3K de la 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizada, y

e) determinar si el compuesto puede separar también ATM, ATR, DNAPK y/o mTOR de la 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizada.

Obtención del perfil de selectividad de moléculas de interacción con PI3K contra dianas múltiples Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos para la identificación y caracterización de moléculas de interacción con PI3K y para la purificación de PI3K usando 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]propionamida como ligando para PI3K. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas moléculas de interacción por ejemplo para el tratamiento de cáncer, enfermedades metabólicas o trastornos autoinmunitarios/inflamatorios.

Las cinasas catalizan la fosforilación de proteínas, lípidos, azúcares, nucleósidos y otros metabolitos celulares y desempeñan papeles clave en todos los aspectos de la fisiología de células eucariotas. Especialmente, las proteína cinasas y lípido cinasas participan en los acontecimientos de señalización que controlan la activación, el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia de las células en respuesta a estímulos o mediadores extracelulares tales como factores de crecimiento, citocinas o quimiocinas. En general, las proteína cinasas se clasifican en dos grupos, las que fosforilan preferentemente residuos de tirosina y las que fosforilan preferentemente residuos de serina y/o treonina.

La actividad proteína cinasa inapropiadamente alta está implicada en muchas enfermedades incluyendo cáncer, enfermedades metabólicas y trastornos autoinmunitarios/inflamatorios. Esto puede estar provocado o bien directamente o bien indirectamente por el fallo de los mecanismos de control debido a mutación, sobreexpresión o activación inapropiada de la enzima. En todos estos casos, se espera que la inhibición selectiva de la cinasa tenga un efecto beneficioso.

Un grupo de lípido cinasas que se ha convertido en un punto de atención reciente del descubrimiento de fármacos es la familia de fosfoinosítido 3-cinasa (PI3K) . Miembros de la familia de PI3K son lípido cinasas que catalizan la transferencia del fosfato gamma del ATP al grupo hidroxilo 3' del fosfatidilinositol y sus derivados, denominados conjuntamente fosfoinosítidos. Se han aislado ocho miembros (isoformas) de la familia de PI3K a partir de células de mamífero hasta la fecha y se han agrupado en las tres clases según su estructura primaria y especificidad de sustrato (clase IA: PI3K alfa, beta y delta; clase IB: PI3K gamma; clase II: PI3KC2 alfa, beta y gamma; clase III: homólogo de levadura Vps34) (Fruman et al., 1998. Fosfoinositide cinasas. Annual Review Biochemistr y 67, 481507; Cantley, L.C., 2002, Science 296, 1655-1657) .

Se sabe que las células de mamífero expresan tres isoformas de la subunidad catalítica de la clase IA de P13K (p110 alfa, p110 beta y p110 delta, sinónimo “PI3K delta”) . La clase IB contiene sólo un miembro (subunidad catalítica) que se ha denominado p110gamma o PI3K gamma. Además de su actividad lípido cinasa, PI3K gamma también presenta una actividad serina / treonina proteína cinasa tal como se demuestra mediante autofosforilación.

El estudio de ratones manipulados genéticamente en los que se delecionaron los genes que codifican para PI3K gamma o delta proporciona información importante sobre la función fisiológica de estas cinasas y su posible utilidad como dianas farmacológicas. Ratones que carecen de PI3K gamma o delta son viables y presentan fenotipos característicos que sugieren varias posibles indicaciones terapéuticas. PI3K gamma parece ser un mediador principal del sistema inmunitario innato. Por ejemplo, macrófagos y granulocitos neutrófilos deficientes en PI3K gamma muestran una capacidad deteriorada para infiltrarse en el peritoneo inflamado. Los mastocitos representan otro tipo de célula afectada en ratones deficientes en PI3K gamma. El fenotipo de ratones que carecen de PI3K delta se caracteriza por un deterioro de las funciones del linfocito y apuntan hacia una función dominante en el control de la respuesta inmunitaria adaptativa (Wetzker y Rommel, Current Pharmaceutical Design, 2004, 10, 1915-1922) .

En contraposición a las isoformas PI3K alfa y beta ampliamente expresadas, las isoformas PI3K gamma y delta específicas hematopoyéticas sugieren importantes indicaciones terapéuticas. Ambas isoformas aparecen como dianas ideales para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias/inflamatorias mediadas por fagocitos hiperactivos, mastocitos, linfocitos B y T (por ejemplo artritis reumatoide, asma o reacciones alérgicas) . Con el fin de evitar efectos secundarios no deseados, son necesarios inhibidores altamente selectivos de isoforma (Ohashi y Woodgett 2005, Nature Medicine 11, 924-925) .

Los miembros de la familia de cinasas relacionadas con fosfatidilinositol cinasa (PIKK) son cinasas de alta masa molecular implicadas en la progresión del ciclo celular, la recombinación del ADN y la detección de daño en el ADN. El gen ATM humano, que es defectuoso en células de pacientes con ataxia-telangiectasia y está implicado en la detección y respuesta de células a ADN dañado, es un miembro de esta familia. Otro es mTOR (sinónimo FRAP) , que está implicado en una ruta sensible a rapamicina que conduce a la progresión del ciclo celular a G1 (Shilo, 2003. Nature Reviews Cancer 3, 155-168) .

Un requisito previo para la identificación y caracterización de inhibidores de PI3K es la provisión de ensayos adecuados, preferiblemente formas fisiológicas de la proteína diana. En la técnica, se han propuesto varias estrategias para abordar este tema.

De manera convencional, la actividad lípido cinasa de PI3K puede medirse usando enzima recombinante o purificada en un ensayo basado en disolución con vesículas de fosfolípidos. La reacción se finaliza mediante la adición de disolventes orgánicos acidificados y posterior separación de fases mediante extracción o análisis de cromatografía en capa fina (Carpenter et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 19704-19711) .

Otro ensayo descrito en la técnica se basa en la transferencia de fosfato de ATP radiomarcado a fosfatidilinositol inmovilizado sobre placas. Este tipo de ensayo también usa enzima PI3K gamma recombinante pero puede realizarse en un modo de alto rendimiento (Fuchikami et al., 2002, J. Biomol. Screening 7, 441-450) .

Aún otro ensayo de selección bioquímico se basa en un formato de polarización de fluorescencia (FP) competitiva usando fosfoinosítido marcado con fluoróforo (Drees et al., 2003, Comb. Chem. High Throughput Screening 6, 321330) .

Finalmente, se notificó un ensayo de redistribución de Akt-EGFP basado en células que se basa en la obtención de imágenes microscópicas de fluorescencia y análisis de imágenes automatizado. Con este fin, se transfectaron de manera estable células de ovario de hámster chino (CHO) con el receptor de insulina humano y un constructo de fusión de proteína fluorescente verde potenciada con Akt1 (EGFP) . Tras la estimulación con factor-1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) , se activó la PI3K y se reclutó la proteína Akt1-EGFP a la membrana celular. La validación del ensayo de redistribución con inhibidores selectivos de la isoforma de PI3K demostró que PI3K alfa es la isoforma principal activada en células huésped CHO tras la estimulación con IGF-1 (Wolff et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 9, 339-350) .

Otro requisito previo, aunque no en todos los casos necesario para la identificación de inhibidores de cinasa selectivos, es un método que permite determinar la selectividad de diana de estas moléculas. Por ejemplo, puede preverse proporcionar moléculas que se unen a e inhiben una diana farmacológica particular pero no interaccionan con una diana estrechamente relacionada, cuya inhibición podría conducir a efectos secundarios. De manera convencional, se usan grandes paneles de ensayos enzimáticos individuales para evaluar el efecto inhibidor de un compuesto para cinasas (Knight et al., 2004. Bioorganic and Medicinal Chemistr y 12, 4749-4759; Knight et al., 2006, Cell 125, 733-747) . Más recientemente, se han empleado cinasas o dominios cinasas presentados en bacteriófagos para evaluar la capacidad de un compuesto dado para interaccionar con un gran conjunto de cinasas (Karaman et al., 2008. Nature Biotechnology 26, 127-132) . Además, se han descrito métodos de proteómica química que permiten la obtención del perfil de inhibidores de cinasas frente al proteoma (documento WO 2006/134056; Bantscheff et al., 2007. Nature Biotechnology 25, 1035-1044; Patarrozlly et al., 2007. Biochemistr... [Seguir leyendo]

1. Método para la identificación de un compuesto de interacción con PI3K, que comprende las etapas de a) proporcionar una preparación de proteínas que contiene PI3K,

b) poner en contacto la preparación de proteínas con 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida o sal de la misma inmovilizada sobre un soporte sólido en condiciones que permiten la formación de un complejo de 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida - PI3K,

c) incubar el complejo de 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metiltiazol-2il]-propionamida - PI3K con un compuesto dado, d) determinar si el compuesto puede separar PI3K de la 3- (2-{2-[2- (2-aminoetoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizada, y e) determinar si el compuesto puede separar también ATM, ATR, DNAPK y/o mTOR de la 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizada.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa d) incluye la detección de PI3K separada o la determinación de la cantidad de PI3K separada y/o en el que la etapa e) incluye la detección de ATM, ATR, DNAPK y/o mTOR separados o la determinación de la cantidad de ATM, ATR, DNAPK y/o mTOR separados, preferiblemente, en el que se detectan PI3K, ATM, ATR, DNAPK y/o mTOR separados o se determina la cantidad de PI3K, ATM, ATR, DNAPK y/o mTOR separados mediante métodos de inmunodetección o espectrometría de masas, preferiblemente con un anticuerpo dirigido contra PI3K, ATM, ATR, DNAPK y/o mTOR.

3. Método para la identificación de un compuesto de interacción con PI3K, que comprende las etapas de

a) proporcionar una preparación de proteínas que contiene PI3K,

b) poner en contacto la preparación de proteínas con 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi} -etoxi) -N-[5- (4-cloro-3metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida o sal de la misma inmovilizada sobre un soporte sólido y con un compuesto dado en condiciones que permiten la formación de un complejo de 3- (2-{2-[2- (2-aminoetoxi) -etoxi]-etoxi}etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonilfenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida - PI3K, c) detectar el complejo de 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metiltiazol-2il]-propionamida - PI3K formado en la etapa b) , y d) detectar si también se ha formado un complejo entre la 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida y ATM, ATR, DNAPK y o mTOR en la etapa b) .

4. Método según la reivindicación 3, en el que en la etapa c) dicha detección se realiza determinando la cantidad del complejo de 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]propionamida - PI3K y/o en el que en la etapa d) se determina la cantidad de un complejo entre la 3- (2-{2-[2- (2aminoetoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida y ATM, ATR, DNAPK y o mTOR.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, en el que las etapas a) a c) se realizan con varias preparaciones de proteínas con el fin de someter a prueba diferentes compuestos.

6. Método para la identificación de un compuesto de interacción con PI3K, que comprende las etapas de:

a) proporcionar dos alícuotas de una preparación de proteínas que contiene PI3K, b) poner en contacto una alícuota con la 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonilfenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida o sal de la misma inmovilizada sobre un soporte sólido en condiciones que permiten la formación de un complejo de 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonilfenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida - PI3K,

c) poner en contacto la otra alícuota con la 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida o sal de la misma inmovilizada sobre un soporte sólido y con un compuesto dado en condiciones que permiten la formación de un complejo de 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]

etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonilfenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida - PI3K,

d) determinar la cantidad del complejo de 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida - PI3K formado en las etapas b) y c) , y e) determinar si también se ha formado un complejo entre la 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (45 cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida y ATM, ATR, DNAPK y o mTOR en las etapas b) y c) .

7. Método para la identificación de un compuesto de interacción con PI3K, que comprende las etapas de:

a) proporcionar dos alícuotas que comprenden cada una al menos una célula que contiene PI3K,

b) incubar una alícuota con un compuesto dado,

c) recoger las células de cada alícuota, d) lisar las células con el fin de obtener preparaciones de proteínas, e) poner en contacto las preparaciones de proteínas con la 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida o sal de la misma inmovilizada sobre un soporte sólido en condiciones que permiten la formación de un complejo de 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida - PI3K, y f) determinar la cantidad del complejo de 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonilfenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida - PI3K formado en cada alícuota en la etapa e) , y g) determinar si también se ha formado un complejo entre la 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida y ATM, ATR, DNAPK y o mTOR en la etapa e) .

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que una cantidad reducida del complejo de 3- (2-{2

[2- (2-aminoetoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonilfenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida -PI3K formado en la alícuota incubada con el compuesto en comparación con la alícuota no incubada con el compuesto indica que PI3K es una diana del compuesto.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que se determina la cantidad del complejo de 3- (2{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonilfenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida -PI3K

mediante la separación PI3K de la 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) 4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizada y la detección posterior de PI3K separada o la determinación posterior de la cantidad de PI3K separada.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que dicha determinación de si también se ha formado un complejo entre 3- (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil tiazol-2il]-propionamida y ATM, ATR, DNAPK y/o mTOR se realiza mediante la separación de dicha proteína de la 3 (2-{2-[2- (2-amino-etoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizada y la detección posterior de ATM, ATR, DNAPK y o mTOR separados o la determinación posterior de la cantidad de ATM, ATR, DNAPK y o mTOR separados, preferiblemente en el que se detecta dicha proteína o se determina la cantidad de dicha proteína mediante métodos de inmunodetección o espectrometría de masas, preferiblemente con un anticuerpo dirigido contra dicha proteína.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, realizado como una selección de medio o alto rendimiento, y/o en el que dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en compuestos sintéticos, o fármacos sintéticos orgánicos, más preferiblemente fármacos orgánicos de molécula pequeña y compuestos de molécula pequeña naturales.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el compuesto de interacción con PI3K es un inhibidor de PI3K, y/o en el que el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en agarosa, agarosa modificada, perlas de sefarosa (por ejemplo sefarosa activada con NHS) , látex, celulosa y partículas ferro o ferrimagnéticas, y/o en el que la 3- (2-{2-[2- (2-aminoetoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4metil-tiazol-2il]-propionamida está covalentemente acoplada al soporte sólido.

45 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la PI3K es PI3K gamma y/o PI3K delta.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la provisión de una preparación de proteínas

incluye las etapas de recoger al menos una célula que contiene PI3K y lisar la célula.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que las etapas de la formación del complejo de 3 (2-{2-[2- (2-aminoetoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -N-[5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2il]-propionamida - PI3K se realizan en condiciones esencialmente fisiológicas.