Procedimiento y dispositivo para la detección simultánea de anticuerpos unidos a sustratos sintéticos y celulares y/o tisulares.

Un procedimiento para el diagnóstico de enfermedades que comprende la detección simultánea de anticuerposunidos a uno o más sustratos celulares y/o tisulares y a uno o más sustratos sintéticos,

caracterizado por:

a) el suministro de una mezcla de sustratos celulares y/o tisulares y sintéticos

b) la incubación de dicha mezcla de sustratos con el fluido corporal del paciente que contiene el anticuerpo adetectar, permitiendo de esta manera la unión del anticuerpo a detectar con dicha mezcla de sustratos.

c) la detección de sustratos celulares y/o sintéticos y de anticuerpos unidos a dichos sustratos utilizandomicroscopía de fluorescencia, y

d) la evaluación de datos de imágenes de inmunofluorescencia utilizando un sistema automático dereconocimiento e interpretación de patrones.

Procedimiento y dispositivo para la detección simultánea de anticuerpos unidos a sustratos sintéticos y celulares y/o tisulares La invención se refiere a un procedimiento y a un dispositivo para el diagnóstico de enfermedades que detecta simultáneamente anticuerpos unidos a sustratos celulares y/o tisulares y anticuerpos unidos a sustratos sintéticos, tales como micropartículas o perlas revestidas con antígenos específicos, proporcionando de esta manera un procedimiento en “una etapa” para la detección simultánea y caracterización de anticuerpos asociados con enfermedades tanto a baja especificidad (celular y/o tisular) como a alta especificidad (antigénica) .

Antecedentes de la invención En diagnósticos rutinarios se ha establecido la detección de anticuerpos por inmunofluorescencia indirecta (IFI) empleando diferentes sustratos celulares y tisulares como fuentes de antígeno múltiples. Los ensayos de inmunofluorescencia basados en células, tales como la detección de anticuerpos antinucleares (AAN) utilizando células HEp-2, se usan ampliamente en diagnósticos clínicos y en investigación como referencia en el sector (Tan EM, Adv. Immunology 1982; 33:167-240, Costes SV, y col., Radiat Res. 2006; 165 (5) :505-15, Sack U, y col., Ann N Y Acad Sci 2009; 1173:166-73, Conrad K, y col., Ann N Y Acad Sci 2009; 1173:180-185) . Además se conoce la técnica anterior que desvela ensayos de inmunofluorescencia basados en células utilizando células HEp-2 u otras líneas celulares para detectar anticuerpos antinucleares o anti-MTOC (documentos WO 2009/062497, WO 97/06440) , el documento WO 97/06440 desvela procedimientos para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide, mediante un ensayo de este tipo, utilizando, en particular, la línea celular IT-1 de macrófagos.

La demanda creciente de lectura automática e interpretación de patrones de fluorescencia, que den como resultado una mejor normalización y rentabilidad, ha sido posible gracias a un sofisticado programa informático de reconocimiento de patrones y a lectores totalmente automáticos ya disponibles en la actualidad (Hou YN, y col., Radiat Res. 2009; 171 (3) :360-7, Hiemann R, y col., Ann N Y Acad Sci 2007;1109:358-71, Böcker W, y col., Radiat Res. 2006;165 (1) :113-24. Hiemann R, y col., Autoimmun Rev. 2009; 9:17-22) .

Sin embargo, avances realizados en el desarrollo de ensayos y la tecnología recombinante han preparado el camino para la detección de especificidades de autoanticuerpos contra dianas antigénicas individuales mejorando de esta manera el poder de diagnóstico de los ensayos con anticuerpos. La creciente diversidad de anticuerpos encontrados en diferentes trastornos, tales como enfermedades infecciosas y reumáticas, ha generado la necesidad de técnicas innovadoras, que superen los inconvenientes de la detección de anticuerpos únicos y que disminuyan el coste y el tiempo de presentación de resultados. Por consiguiente, recientemente se han desarrollado plataformas múltiples para atender la demanda de determinaciones simultáneas de diversas especificidades de anticuerpos en una muestra. Ensayos múltiples basados en citometría de flujo basada en perlas fluorescentes y los sistemas de micromatrices han demostrado ser herramientas poderosas que dan soporte a análisis de más alto rendimiento y a ensayos más exhaustivos de las muestras de pacientes (Avaniss-Aghajani E, y col., Clin Vaccine Immunol. 2007; 14:505-9, Lal G, y col., J Immunol Methods 2005; 296:135-47) .

Como ejemplo, los autoanticuerpos (AAC) específicos de enfermedades, son un fenómeno serológico de afecciones reumáticas sistémicas y trastornos hepáticos autoinmunes. En particular, la detección de AAN por IFI fue una de las primeras técnicas disponibles en laboratorios habituales para el diagnóstico serológico de enfermedades reumáticas sistémicas. A pesar del desarrollo del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y de las tecnologías de formación de complejos múltiples para la detección de AAC específicos de enfermedades, la detección de AAN por ensayos de IFI sigue siendo el procedimiento de referencia en la estrategia actual de diagnóstico multifase. Se han propuesto diversos sustratos para los ensayos de AAN por IFI, sin embargo, el procedimiento más establecido es la exploración de AAC no específicos de órganos en células HEp-2.

En general, después de la evaluación de AAN se realiza la detección de AAC específico para, por ejemplo, antígenos nucleares extraíbles (ANE) y antígenos citoplasmáticos por inmunoensayos que emplean antígenos naturales purificados o recombinantes. Esta estrategia en dos fases presenta los siguientes beneficios: (i) detección altamente sensible de los AAC más frecuentes, no específicos de órganos, clínicamente relevantes, (ii) combinación óptima con otras técnicas de ensayo por la diferenciación aguas abajo de reactividades de los AAC basándose en el patrón de IFI detectado y en la sospecha del diagnóstico (por ejemplo, SS-A/Ro y SS-B/La) , (iii) evaluación de AAC clínicamente relevantes sin la necesidad de más ensayos (por ejemplo, AAC anti-centrómero) y (iv) evaluación de AAC solo detectable por IFI en el caso de dianas autoantigénicas desconocidas o ensayos no disponibles comercialmente.

Otro ejemplo es la detección de anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ACAN) para el diagnóstico diferencial de vasculitis sistémica (Bosch X, y col., Lancet 2006; 368:404-18) . Debido a la aparición de ACAN en estos trastornos autoinmunes sistémicos la expresión vasculitis asociada a ACAN (VSAA) se ha acuñado para estas entidades clínicas. Los ACAN se descubrieron por IFI, que aún es el procedimiento recomendado para detectar estas reactividades de anticuerpos. Generalmente los ACAN muestran dos patrones de tinción diferentes de granulocitos

fijos en IFI; un patrón citoplasmático moteado (C-ACAN) y un patrón perinuclear (P-ACAN) . El C-ACAN se encuentra frecuentemente en pacientes con granulomatosis de Wegener (GW) , se dirige contra la proteinasa 3 (PR3) , mientras que el P-ACAN, producido principalmente en la poliangitis microscópica (PAM) , se dirige contra la mieloperoxidasa (MPO) (Van der Woude FJ, y col., Lancet 1985; 1:425-9) .

Se ha propuesto que las estimaciones de las concentraciones de anticuerpos, son útiles en el diagnóstico y el tratamiento de estas entidades clínicas. Los valores de anticuerpo normalmente se asocian con la gravedad de la enfermedad (Cohen Tervaert JW, y col., Arch Intern Med 1989; 149: 2461-5) . Sin embargo, ha habido otros antígenos diana para ACAN descritos en IFI que pueden encontrarse en pacientes sin VSAA (Savige J, y col., Best. Pract. Res. Clin. Rheumatol. 19: 263-76, Savige J, y col., Am J Clin Path 2003; 120:312-8) . En consecuencia, de acuerdo con las directrices consenso establecidas recientemente, además de la IFI, para la detección de ACAN se recomienda una técnica diferente, tal como ELISA.

Sin embargo, las técnicas empleadas para determinar diversos anticuerpos mediante la estrategia multifase mencionada anteriormente implican una pluralidad de ensayos de constituyentes marcados individualmente. Con respecto a la rentabilidad de los diagnósticos serológicos hay una clara demanda de combinar, por un lado, la detección de anticuerpos contra dianas antigénicas celulares y tisulares y, por otro lado, contra sus polipéptidos caracterizados y purificados, en un solo procedimiento con un marcador.

La caracterización actual de proteínas mediante tecnología de micromatrices no proporciona por sí sola ninguna solución satisfactoria. Al aumentar el número de dianas antigénicas a ensayar en una sola micromatriz, la demanda de equipos de fabricación asociados, la miniaturización y los materiales y el manejo especializados, harán que la producción de dichas micromatrices sea cada vez más compleja y costosa. Otras técnicas, incluyendo el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) , el radioinmunoensayo (RIA) , los ensayos cromogénicos, la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) , la cromatografía de gases-espectroscopia de masas (GC-MS) , y la cromatografía de capa fina (TLC) , presentan la desventaja de estar limitadas en cuanto al número de analitos en forma antigénica que puedan evaluarse simultáneamente. Además requieren mucho tiempo y equipos costosos. Por el contrario, empleando un sustrato de células HEp-2 para la detección de AAN se proporcionan más de 1.200 dianas antigénicas para la identificación de anticuerpos.

Sumario de la Invención En vista del problema técnico subyacente de la técnica anterior, la presente invención proporciona un procedimiento para el diagnóstico de enfermedades, que reduce un diagnóstico multi-etapa... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para el diagnóstico de enfermedades que comprende la detección simultánea de anticuerpos unidos a uno o más sustratos celulares y/o tisulares y a uno o más sustratos sintéticos, caracterizado por:

a) el suministro de una mezcla de sustratos celulares y/o tisulares y sintéticos b) la incubación de dicha mezcla de sustratos con el fluido corporal del paciente que contiene el anticuerpo a detectar, permitiendo de esta manera la unión del anticuerpo a detectar con dicha mezcla de sustratos. c) la detección de sustratos celulares y/o sintéticos y de anticuerpos unidos a dichos sustratos utilizando microscopía de fluorescencia, y d) la evaluación de datos de imágenes de inmunofluorescencia utilizando un sistema automático de reconocimiento e interpretación de patrones.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el sustrato celular o tisular es de células HEp-2, de granulocitos humanos y/o de tejido pancreático.

3. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que el sustrato sintético es una micropartícula o una perla revestidas con antígeno natural purificado y/o antígeno recombinante.

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el antígeno que reviste el sustrato sintético está unido a anticuerpos asociados con una enfermedad.

5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las características ópticas, fluorescentes y/o físicas de los diversos sustratos se utilizan para identificar dichos sustratos.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que para identificar dichos sustratos y/o autoanticuerpos unidos se utiliza la microscopía de fluorescencia multicolor, presentando los sustratos y/o los anticuerpos unidos diferentes colores fluorescentes.

7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el sustrato celular está marcado con DAPI, el sustrato sintético está marcado con FITC y/o el anticuerpo unido específicamente se detecta mediante un anticuerpo específico anti-inmunoglobulina humana marcado con Cy5.

8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la enfermedad es un trastorno autoinmune o infeccioso, preferentemente una afección reumática sistémica, un trastorno autoinmune hepático, diabetes de Tipo-1, enfermedad de Lyme o virus del herpes simple.

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los anticuerpos a detectar son anticuerpos antinucleares (AAN) o anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ACAN) .

10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos muestran una tinción perinuclear (p-ACAN) o una tinción citoplasmática moteada (c-ACAN) de granulocitos humanos.

11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los anticuerpos se dirigen contra la Proteinasa 3 (PR3) o la mieloperoxidasa (MPO) .

12. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el fluido corporal es sangre, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial o saliva del paciente.

13. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el sistema de interpretación está controlado por un programa informático especialmente diseñado, que consiste en módulos para control de dispositivos y autoenfoque, análisis de imágenes y/o algoritmos de reconocimiento de patrones.

14. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que para evaluar los datos de imágenes por inmunofluorescencia se utiliza el sistema de interpretación de acuerdo con la siguiente jerarquía:

i) señal de tinción positiva, ii) localización de la tinción (clasificación de patrones de tinción en células/tejidos o micropartículas) , y iii) determinación de patrones celulares/tisulares (perinuclear, citoplasmático para granulocitos; nuclear, citoplasmático, cromatínico de células mitóticas para células HEp-2) .

15. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la clasificación de los patrones de tinción en células/tejidos o micropartículas y la determinación de patrones celulares/tisulares se consigue a través de una combinación de características de estructura y textura de la imagen de inmunofluorescencia definiendo una serie de reglas para cada patrón.

16. Un kit para realizar el procedimiento de las reivindicaciones 1-15 para la detección simultánea de anticuerpos unidos a uno o más sustratos celulares y a uno o más sustratos sintéticos, que comprende

a) Portaobjetos con sustrato celular y/o tisular fijado, mezclado con el sustrato sintético revestido con antígeno, mediante los cuales i. el sustrato celular y/o tisular es preferentemente de células HEp-2 o de granulocitos humanos, y

ii. los sustratos sintéticos se diferencian entre sí de acuerdo con sus características ópticas, fluorescentes y/o físicas, y

b) Conjugado con anticuerpos específicos contra inmunoglobulina conjugados con un marcador fluorescente, preferentemente FITC o Cy5, y opcionalmente c) tampón de lavado, cubreobjetos, medio de revestimiento, sustrato sintético no revestido con antígeno, con o sin marcador fluorescente, y/o marcadores fluorescentes adicionales para sustratos sintéticos.