Dispositivo y procedimiento para la detección de micotoxinas.

Procedimiento para la detección rápida de micotoxinas, que comprende las siguientes etapas:

a) preparar un guiaondas de capa fina que comprende una primera capa (a) de guiaondas ópticamentetransparente sobre una segunda capa (b) ópticamente transparente, en donde (b) posee un índice derefracción menor que (a), y donde sobre la capa (a) se inmovilizan separados espacialmente conjugados dealbúmina de suero bovino y micotoxina como elemento de reconocimiento químico o bioquímico para un entede unión que se une a micotoxina,

b) aplicación de una muestra que contiene micotoxina(s) y de entes de unión que se unen a micotoxina a losconjugados de albúmina de suero bovino y micotoxina inmovilizados sobre el guiaondas de capa fina, dondeun elemento de marcado está unido a un ente de unión o a los conjugados de albúmina de suero bovino ymicotoxina inmovilizados,

c) detectar una señal en el campo de evanescencia que se origina por el cambio de las propiedades ópticasen la interfaz con el guiaondas debido a la interacción de los conjugados de albúmina de suero bovino ymicotoxina inmovilizados sobre el guiaondas de capa fina con los entes de unión que se unen a lamicotoxina,

después

d) determinar la cantidad de micotoxina(s) presente(s) en la muestra.

Dispositivo y procedimiento para la detección de micotoxinas La invención se refiere a un dispositivo y a un procedimiento para la detección de micotoxinas así como a kits que son adecuados para la realización del procedimiento.

La detección de micotoxinas comprende un gran campo de aplicación, por ejemplo, en el sector de la alimentación y de los piensos, en la analítica ambiental, en protección fitosanitaria así como en la investigación bioquímica.

Las micotoxinas son sustancias tóxicas producidas por mohos con estructura química muy diversa. Las micotoxinas se originan en productos de cosecha como cereales, semillas que contienen aceite y frutos y pueden ser la causa de intoxicaciones en humanos y animales. Se han identificado hasta la fecha más de 300 micotoxinas distintas que se clasifican en aproximadamente 25 tipos de estructura y muestran distintos efectos tóxicos. Las micotoxinas pueden provocar, según cada tipo de toxina, intoxicaciones agudas o crónicas. Comúnmente grupos que provienen de micotoxinas son aflatoxinas, ocratoxinas, alcaloides del cornezuelo del centeno, patulina y fusariotoxina. Entre las fusariotoxinas son de especial relevancia el desoxinivalenol, zearalenona, nivalenol, toxina T-2/HT2 y la fumonisina, ya que son frecuentes en productos de cereales. En consecuencia se debería realizar un ensayo de micotoxinas, por ejemplo, de toxinas de hongos de los cultivos, por ejemplo fusariotoxinas, o de toxinas de hongos de almacén en puntos de recepción de cereales, en manipuladores de cereales así como procesadores de cereales, por ejemplo, molinos, malterías, fabricantes de piensos, en agricultura, consejos reguladores, universidades o ministerios, por ejemplo, el ministerio de consumo, para asegurar la calidad de los alimentos.

En el estado de la técnica se conocen una serie de procedimientos para la detección de micotoxinas. La detección de micotoxinas se realiza, por ejemplo, mediante procedimientos cromatográficos como HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) , que pueden estar acoplados con detección basada en fluorescencia, absorción o de espectroscopia de masas. Previo al análisis por HPLC, por ejemplo de una muestra de cereal, se realiza en general el enriquecimiento y purificación del analito mediante columnas de inmuno-afinidad. Son desventajas de todos los procedimientos basados en HPLC la elevada inversión, la manipulación de muestras relativamente compleja así como los prolongados tiempos de análisis. Debido a las desventajas citadas los procedimientos de detección basados en HPLC no son adecuados para análisis rápidos, económicos y sencillos, por ejemplo, de muestras de cereales en operaciones de producción, recepción, manipulación o procesamiento de cereales. Es su lugar se realiza el análisis basado en HPLC en laboratorios de análisis especializados. Como consecuencia en la práctica el resultado se proporciona ya con un retraso temporal de varios días.

Un procedimiento alternativo para la detección de micotoxinas es la técnica ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) . Para el ensayo ELISA se preparan placas de microtítulos, cuyos pocillos están recubiertos por ejemplo con captadores-anticuerpos, que se unen de forma específica a una micotoxina. Son desventajas del ensayo ELISA las múltiples etapas de pipeteado, lavado e incubación que pueden llevar a tiempos de análisis relativamente largos de más de 30 minutos. Esto impide llevar a cabo el ensayo rápidamente in situ fuera de un laboratorio analítico. Además de esto el ensayo no permite la detección simultánea de varios analitos, ya que en general se recubre cada placa de microtítulos sólo con un tipo de anticuerpos.

Otro procedimiento para la detección de micotoxinas son ensayos de flujo lateral (LFA) . Para la detección de micotoxinas por medio de LFA se puede considerar, por ejemplo, un inmunoensayo directo, competitivo sobre una tira de nitrocelulosa, en donde la muestra que se va a analizar se hace pasar por toda la tira de nitrocelulosa mediante fuerzas capilares. Es desventajoso que el procedimiento permita sólo una detección de micotoxina cualitativa. Además es desventajoso que para cada micotoxina en este ensayo sea necesaria una tira por separado.

En el estado de la técnica se encuentran también trabajos para el desarrollo de procedimientos de detección para micotoxinas, por ejemplo, como describen M. M. Ngundi y col., Anal. Chem. 2005, 77, 148 a 154. En este procedimiento se hace referencia a un inmunoensayo indirecto, competitivo para la detección de ocratoxina A, inmovilizándose la ocratoxina A sobre portaobjetos de cristal. La mezcla de un anticuerpo marcado con fluorescencia contra ocratoxina A y la muestra que se va a determinar se añade sobre los portaobjetos de vidrio y tras la separación de los anticuerpos no unidos mediante lavado se pueden leer estos. Es desventajoso en este procedimiento que sean necesarias etapas de lavado y tiempos de incubación de 10 a 20 minutos y que se requieran sistemas de emisión de imagen de fluorescencia costosos para la lectura de los resultados. Por estos motivos esto no posibilita desarrollar un ensayo rápido que se pueda realizar in situ, fuera de un laboratorio analítico.

F.S. Ligler y col., Analytical and Bioanalytical Chemistr y , 2003, 377, 3, 469-777 describe un procedimiento de análisis de micotoxinas por medio de un sensor matricial de guiaondas en un fluoroinmunoensayo competitivo. Para determinar la fumonisina micotoxina se seleccionó un ensayo competitivo, donde la fumonisina se inmoviliza en la superficie del sensor y se incuba con una mezcla de anticuerpos anti fumonisina Cy5 marcados con fluorescencia y muestra.

Los procedimientos conocidos en el estado de la técnica para la detección de micotoxinas necesitan por tanto grandes costes de inversión debido a los complicados equipos de lectura, implican muchas etapas manuales, o no son de utilidad fuera de un laboratorio analítico.

La presente invención se basa por tanto en el objetivo de proporcionar un procedimiento que supere al menos una de las desventajas del estado de la técnica previamente citadas, especialmente un procedimiento que haga posible la detección rápida, de manipulación sencilla y económica de micotoxinas en una muestra.

Este objetivo se consigue mediante un procedimiento para la detección rápida de micotoxinas que comprende las siguientes etapas:

Se describe además un dispositivo para la realización del procedimiento para la detección de micotoxinas.

Otro objeto es un kit adecuado para la realización del procedimiento para la detección de micotoxinas.

Resultan otras configuraciones ventajosas de la invención a partir de las reivindicaciones subordinadas.

De forma sorprendente, se encontró que el procedimiento de acuerdo con la invención para la detección de micotoxinas se realiza de forma sencilla, y se puede realizar fuera de laboratorios de análisis especializados. Esto posibilita que se pueda realizar el procedimiento de acuerdo con la invención en forma de un ensayo rápido, sin que se deban entregar muestras necesariamente a un laboratorio para el análisis. Además es ventajoso que la detección de micotoxina según el procedimiento de acuerdo con la invención no necesita, o sólo pocas, etapas de lavado. Esto es especialmente ventajoso ya que la realización de etapas de lavado lleva tiempo, retrasa la obtención de un resultado de análisis, y especialmente en la realización poco cuidadosa o inadecuada los resultados del análisis se alteran o puede hacer completamente imposible la detección.

La combinación de propiedades ventajosas del procedimiento de acuerdo con la invención hace posible que se pueda realizar una detección de micotoxinas en alimentos, por ejemplo, en puntos de recepción de cereales, en manipuladores de cereales o procesadores de cereales. Especialmente a) preparar un guiaondas de capa fina que comprende una primera capa (a) de guiaondas ópticamente transparente sobre una segunda capa (b) ópticamente transparente, en donde (b) posee un índice de refracción menor que (a) , y donde sobre la capa (a) se inmovilizan separados espacialmente conjugados de albúmina de suero bovino y micotoxina como elemento de reconocimiento químico o bioquímico para un ente de unión que se une a micotoxina,

b) aplicación de una muestra que contiene micotoxina (s) y de entes de unión que se unen a micotoxina a los conjugados de albúmina de suero bovino y micotoxina inmovilizados sobre el guiaondas de capa fina, donde un elemento de marcado está unido a un ente de unión o a los conjugados de albúmina de suero bovino y micotoxina inmovilizados,

c) detectar una señal en el campo de evanescencia que se origina por el cambio... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la detección rápida de micotoxinas, que comprende las siguientes etapas:

a) preparar un guiaondas de capa fina que comprende una primera capa (a) de guiaondas ópticamente transparente sobre una segunda capa (b) ópticamente transparente, en donde (b) posee un índice de refracción menor que (a) , y donde sobre la capa (a) se inmovilizan separados espacialmente conjugados de albúmina de suero bovino y micotoxina como elemento de reconocimiento químico o bioquímico para un ente de unión que se une a micotoxina,

b) aplicación de una muestra que contiene micotoxina (s) y de entes de unión que se unen a micotoxina a los conjugados de albúmina de suero bovino y micotoxina inmovilizados sobre el guiaondas de capa fina, donde un elemento de marcado está unido a un ente de unión o a los conjugados de albúmina de suero bovino y micotoxina inmovilizados,

c) detectar una señal en el campo de evanescencia que se origina por el cambio de las propiedades ópticas en la interfaz con el guiaondas debido a la interacción de los conjugados de albúmina de suero bovino y micotoxina inmovilizados sobre el guiaondas de capa fina con los entes de unión que se unen a la micotoxina,

después d) determinar la cantidad de micotoxina (s) presente (s) en la muestra.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque sobre la capa (a) se aplican monocapas o capas múltiples de ácidos organofosfóricos según la siguiente fórmula (I)

R-OPO3H2 (I)

y/o ácidos organofosfónicos según la siguiente fórmula (II)

R-PO3H2 (II)

y/o sus sales, en donde R representa alquilo con C10 a C24.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque se usan ácidos organofosfóricos, ácidos organofosfónicos, organofosfatos y/o organofosfonatos, seleccionándose R del grupo constituido por alquilo no ramificado con C10 a C20, seleccionándose preferiblemente del grupo constituido por alquilo no ramificado con C12 a C18, preferiblemente ácidos organofosfóricos, ácidos organofosfónicos, organofosfatos y/o organofosnafatos seleccionados del grupo constituido por ácido dodecilfosfórico, fosfato de dodecilo, fosfonato de octadecilo y/o ácido octadecilfosfónico.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se usa un guiaondas de capa fina que comprende una capa (a) de guiaondas ópticamente transparente que comprende óxidos seleccionados del grupo constituido por TiO2, ZnO, Nb2O5, Ta2O5, HfO2 y/o ZrO2, seleccionados preferiblemente del grupo constituido por TiO2, Ta2O5 y/o Nb2O5.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se seleccionan los entes de unión que se unen a micotoxina del grupo constituido por anticuerpo anti-micotoxina, conjugados de anticuerpo anti-micotoxina, fragmentos de anticuerpo anti-micotoxina, péptidos que se unen a micotoxina, anticalinas que se unen a micotoxina, aptámeros que se unen a micotoxina, espiegelmeros que se unen a micotoxina y/o polímeros impresos que se unen a micotoxina, preferiblemente seleccionados del grupo constituido por anticuerpo anti-micotoxina, conjugados de anticuerpo anti-micotoxina.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se une a micotoxinas un elemento de marcado, preferiblemente un fluoróforo, por medio de una proteína, preferiblemente por medio de albúmina de suero bovino.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la muestra es un alimento

para seres humanos o animales, seleccionada preferiblemente del grupo constituido por cereales, vino, zumos, frutos y/o productos que contienen cereales, vino, zumos y/o frutos, o un extracto de alimentos o productos extraído con un disolvente o una mezcla de disolventes.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se incuba la muestra menos de 15 minutos, preferiblemente menos de 10 minutos antes de la detección de la señal con los

conjugados de albúmina de suero bovino y micotoxina como elemento de reconocimiento químico o bioquímico y/o los entes de unión que se unen a micotoxina.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las micotoxinas se seleccionan del grupo constituido por aflatoxinas, ocratoxinas, alcaloides del cornezuelo del centeno, patulina y/o

fusariotoxinas, seleccionadas por ejemplo del grupo constituido por desoxinivalenol, nivalenol, zearalenona, toxina T-2, toxina HT-2 y/o fumonisinas, preferiblemente seleccionadas del grupo constituido por ocratoxina A, desoxinivalenol, nivalenol, zearalenona, toxina T-2, toxina HT-2, fumonisina B1, fumonisina B2 y/o fumonisina B3.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la detección se lleva a 10 cabo en forma de un inmunoensayo.

11. Kit para la detección rápida de micotoxinas, caracterizado porque el kit contiene al menos un guiaondas de capa fina que comprende una primera capa (a) de guiaondas ópticamente transparente sobre una segunda capa (b) ópticamente transparente, en donde (b) posee un índice de refracción menor que (a) , y donde sobre la capa (a) de guiaondas se inmovilizan separados espacialmente conjugados de albúmina de suero bovino y micotoxina 15 como elemento de reconocimiento químico o bioquímico para un ente de unión que se une a micotoxina,

12. Kit según la reivindicación 11, caracterizado porque el kit contiene un reactivo que comprende entes de unión que se unen a micotoxina preferiblemente marcados con fluorescencia.

13. Uso de un kit según una de las reivindicaciones precedentes para la detección rápida de micotoxinas.